一种高效新城疫dna疫苗的分子佐剂及其制备方法和应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于疫苗技术领域，特别涉及一种高效新城疫DNA疫苗的分子佐剂及其制 备方法和应用。
【背景技术】
[0002] 新城疫是由新城疫病毒引起的禽类的急性、高度接触性传染病，免疫预防新城疫 一直应用灭活疫苗或者弱毒苗，但是灭活疫苗免疫保护期短，而弱毒苗免疫保护效果好，但 存在潜在毒力返强及与野毒基因重组的危险，因此，对DNA疫苗的研究越来越多。F基因是 NDV的主要毒力因子与保护性抗原，但是，根据文章表明，单独的F基因构建的DNA疫苗通 过普通的肌肉注射，是达不到理想保护效率，因此，对分子佐剂和免疫途径则需要进行进一 步的探索。IL-12是一种由的异源二聚体蛋白组成的细胞因子，编码IL-12两个亚基（p35、 P40)的基因位于不同的染色体上，二者分别合成后再通过亚基间二硫键结合成具有生物学 活性的二聚体分子（P70)。单独的亚基不具有生物学作用，IL-12能够促进T淋巴细胞、NK 细胞的分化与增殖，调控细胞免疫，提高NK/LAK细胞的杀伤功能和特异性CTL细胞的应答 能力，诱导γ干扰素的产生；因此，选择IL12作为佐剂能够增强核酸疫苗的免疫效果。此 外，电穿孔是功能强大的将核酸、蛋白及其它分子导入多种细胞的高效技术。通过高强度的 电场作用，瞬时提高细胞膜的通透性，从而吸收周围介质中的外源分子。与普通的肌肉注射 相比，电穿孔能有效的减免DNA疫苗在进入细胞过程中的损失，提高了疫苗的表达效率，有 效地减少了剂量，提高免疫效果。
【发明内容】
[0003] 本发明的目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供一种高效新城疫DNA疫苗 的分子佐剂。所述的分子佐剂为重组鸡白细胞介素12(rhIL-12)真核表达载体，所述的 rIL-12真核表达载体（pCAGGS-IL12)与DNA疫苗共同通过电穿孔的方法免疫动物，发挥分 子佐剂的作用。rIL-12佐剂能够克服新城疫DNA疫苗研究中保护率较低的困难，提供一种 有效的DNA疫苗佐剂及一种高效率的免疫途径。
[0004] 本发明的另一目的在于提供上述分子佐剂的制备方法。
[0005] 本发明的再一目的在于提供上述分子佐剂的应用。
[0006] 本发明的目的通过下述技术方案实现：一种高效新城疫DNA疫苗的分子佐剂，为 重组鸡白细胞介素12(rhIL-12)的真核表达载体pCAGGS-IL12。
[0007] 所述的重组鸡白细胞介素12通过下述的四对引物扩增的获得：
[0008] IL12亚单位P40的扩增引物对：
[0020] 上述的高效新城疫DNA疫苗的分子佐剂的制备方法为：
[0021] 采用（G4S) 3疏水的柔性氨基酸接头连接的方案获取rIL-12的P40、P35融合基 因，融合基因插入真核表达质粒PCAGGS，构建pCAGGS-IL12。上述载体的构建方法不仅可保 证P40、P35两亚基以1 : 1比率表达，而且柔性氨基酸接头可使两个亚基充分延展、正确折 叠，从而获得最大的生物学活性。
[0022] 上述的采用（G4S) 3疏水的柔性氨基酸接头连接的方案获取rIL-12的P40、P35融 合基因的制备方法，包括以下步骤：
[0023] (1)首先单独设计引物分别扩增IL12亚单位P40和P35,获得IL12亚单位P40和 P35基因片段，其中IL12亚单位P40的扩增引物对序列如下：
[0029] (2)以步骤（1)扩增获得IL12亚单位P40和P35基因片段为模板，用含酶切位点 和互补的linker(G4S) 3的连接引物去扩增，获得IL12亚单位P40和P35基因的拼接片段， 上游目的基因P40去掉终止密码子TTA，下游目的基因P35去掉起始密码子ATG，所述的连 接引物如下：
[0030] 其中，IL12亚单位P40的拼接引物对序列如下：
[0036] (3)再次分别以步骤⑵胶回收获得的拼接片段产物按照总量1:1的比例，加入 Taq酶和dNTPs，PCRbuffer，进行第一轮PCR反应，循环数为8~12 ;第一轮PCR反应后取 出2μL反应混合物作为模板，以IL12-p40-F2和IL-12-p35-R2为模版，进行第二轮PCR，循 环数28~35 ;产物回收，送测序鉴定正确后获得采用（G4S) 3疏水的柔性氨基酸接头连接 的方案获取rIL-12的Ρ40、Ρ35融合基因。
[0037] 上述的高效新城疫DNA疫苗的分子佐剂的应用，具体体现在将重组鸡白细胞介素 12 (rhIL-12)真核表达载体与新城疫DNA疫苗共同通过电穿孔的方法免疫动物，重组鸡白 细胞介素12 (rhIL-12)真核表达载体发挥分子佐剂的作用。
[0038] pCAGGS-IL12的基因佐剂功能研究：pCAGGS-IL12与pCAGGS-F核酸疫苗通过电穿 孔方法在SPF鸡体内共免疫。检测其对核酸疫苗的基因佐剂功能。
[0039] 本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：
[0040] 本发明成功地构建了重组鸡白细胞介素12的单链双亚基真核表达质粒 (PCAGGS-IL12)，不仅可保证P40、P35两亚基以1:1比率表达，而且柔性氨基酸接头可使 两个亚基充分延展、正确折叠，从而获得最大的生物学活性。PCAGGS-IL12与pCAGGS-F核酸 疫苗通过电穿孔方法在SPF鸡体内共免疫，可显著增强核酸疫苗的免疫效果，发挥理想的 基因佐剂功能。本发明中rIL-12佐剂能够克服新城疫DNA疫苗研究中保护率较低的困难， 提供一种有效的DNA疫苗佐剂及一种高效率的免疫途径。电穿孔方法减免DNA疫苗在进入 细胞过程中的损失，提高了疫苗的表达效率，减少了疫苗有效使用量，经济实用。
【附图说明】
[0041] 图1为实施例1中PCR检测的结果图；其中图1:M:MarkerDL:2000， l-13:pCAGGS-IL12 菌液PCR;14:PCR阴性对照。
[0042] 图2为间接免疫荧光结果检测的结果图；其中：A为pCAGGSHL12转染，B为空载 体pCAGGS转染。
【具体实施方式】
[0043] 下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限 于此。
[0044] 实施例1
[0045] 1.实验所用主要材料和试剂：本发明使用的真核表达载体为pCAGGS。鸡白细胞介 素12基因由脾脏扩得。P40、P35两个亚基由linker(G4S)3连接，本连接不仅可保证P40、 P35两亚基以1 : 1比率表达，而且柔性氨基酸接头可使两个亚基充分延展、正确折叠，从而 获得最大的生物学活性。使用的限制性内切酶EcoRl、Xhol，T4DNA连接酶、ExTaq酶、预 混RTaq等均为普通试剂。
[0046] 2.扩增引物设计：引物的设计及合成是根据国内外已在GenBank中登录的鸡白 细胞介素12基因序列经多重比较后设计。在启动子前，酶切位点之后加入Kozak序列 "GCCACC";根据真核表达载体pCAGGS上的酶切位点，上游引物设计并加上EcoRl酶切位点； 下游引物设计在基因末端，并加上Xho1酶切位点。
[0047] 所述的重组鸡白细胞介素12通过下述的四对引物扩增的获得：
[0048] IL12亚单位P40的扩增引物对：
[0062] 3.鸡白细胞介素12基因片段的扩增：鸡白细胞介素12基因的PCR获取，研磨脾 脏，提取RNA，反转为cDNA，以cDNA为模板，加入Ex Taq DNA聚合酶、引物、dNTP进行扩增 反应。
[0063] ?0?的反应体系为：，4父(1犯1311^(2.5臟〇1/1)4 4 1^上、下游引物（2(^111〇1/1)各 1 μ L，cDNA 1. 5 μ L，ddH20 41. 5 μ L，Ex Taq酶1 μ L。
[0064] PCR反应参数为：94°C处理4min，然后94°C 30s、55°C 30s、72°C 2min，共35个循环， 72°C延伸lOmin。PCR产物在1. 0%琼脂糖凝胶电泳观察，可分别见约950bp和650bp40和 ILp35的扩增条带，融合后可见大小与预期的结果（目标长度1605bp)-致的IL12条带，初 步确定扩增片段的正确性。
[0065] 4.鸡白细胞介素12基因克隆入pMD-19T Vector :将鸡白细胞介素12基因的 PCR产物用Omega胶回收试剂盒进行胶回收。鸡白细胞介素12基因的PCR纯化产物连接 入pMD_19T Vector，载体连接反应体系为：Ligation Solution I 5yL、PCR纯化产物 4. 5 μ L、pMD-19T Vector 1 μ L ;16°C连接过夜，将连接产物转化DH5a感受态细胞，在含有 氨苄青霉素的LB平板上37°C培养；挑选单个菌落，进行PCR鉴定，并抽提质粒，送测序鉴 定。