间充质干细胞来源的外泌体的用图
【技术领域】
[0001]本发明属于药物研发，细胞生物学、分子生物学领域。涉及间充质干细胞(mesenchymal stem cell，MSC)中活性成分外泌体(exosome)在制备治疗眼科疾病药物中的应用。
【背景技术】
[0002]目前已知间充质干细胞(MSC)在治疗各种组织损伤以及免疫性疾病中发挥作用。我们也证明，MSC在包括视网膜缺血再灌注、糖尿病视网膜病变、葡萄膜视网膜炎、视网膜变性以及视网膜损伤等多种眼科疾病模型中具有治疗作用。MSC可以从数种成人组织(包括骨髓、脂肪组织、脐带血)分离，并离体扩充。然而，由于MSC细胞产品保存和运输困难，存在移植存活率低及长期临床应用可能存在致瘤隐患等不足使得其临床应用受到限制，因此，寻找一种操作简单、安全有效的基于MSC的非细胞疗法显得十分重要。
[0003]外泌体(exosome)是一种提取自细胞培养基上清的膜性囊泡，含有其来源细胞的胞膜和胞质蛋白成分，因此它较易与邻近细胞的胞膜发生融合，进而将一个细胞的胞膜及胞质蛋白传递给另一个细胞，在不同细胞间进行信息传递。此外，许多细胞包括MSC分泌的外泌体还包含着能够在细胞间进行转移的RNA(mRNA及microRNAs)，通过在细胞间水平转移方式激活靶细胞产生一些列生物学效应。因此，外泌体在细胞微环境中具有十分重要的作用。
[0004]Bruno等研究发现MSC可分泌一种直径80nm_l μ m大小的非可溶性微泡，它对急性肾损伤具有修复作用。这些从MSC上清中分离出来的微泡在体外能够促进肾小管上皮细胞的增殖及抗凋亡，将其标记后注射到急性肾损伤动物模型体内，可发现微泡在6h内即在肾损伤部位发生了聚集。2010年，新加坡学者发现MSC细胞分泌的exosome可以减少心脏再灌注损伤。MSC分泌的exosome直径约50-100nm，经免疫共沉淀后发现，exosome表达0)81、⑶9、Alix等蛋白。他们将exosome注入小鼠心肌缺血/再灌注模型，发现可以减少梗塞面积。因此，MSC来源的exosome具有保护心脏的功能。脐带血来源的MSC分泌的exosome也用于缓解肝纤维化。研究表明，脐带血MSC-exosome可减少肝脏表面的纤维化，使之恢复较软的质地，缓解肝脏炎症。在CCL4诱导的肝纤维化模型中，可减少1、3型胶原沉积。这些研究表明，MSC可通过旁分泌外泌体在细胞间进行信息传递进而通过某种机制对受损组织进行修复，这一旁分泌机制为基于MSC的非细胞治疗奠定了重要基础。
[0005]本发明的目的是提供一种间充质干细胞来源的外泌体(exosome)在制备治疗眼科疾病药物中的新用途，为临床治疗眼科疾病开辟新途径。
【发明内容】
[0006]本发明的目的是提供一种间充质干细胞来源的外泌体(exosome)在制备治疗眼科疾病药物中的应用。
[0007]本发明采用的技术方案为:
[0008]本发明提供了一种间充质干细胞来源的外泌体(exosome)在制备治疗眼科疾病药物中的应用。
[0009]所述的间充质干细胞为人脐带来源的间充质干细胞、人胎盘来源的间充质干细胞或人脂肪来源的间充质干细胞。优选地，所述的间充质干细胞为人脐带来源的间充质干细胞或人胎盘来源的间充质干细胞。更优选地，所述的间充质干细胞为人脐带来源的间充质干细胞。
[0010]所述的眼科疾病包括葡萄膜炎、视网膜脱离、视网膜变性、各种原因导致的视网膜损伤和炎症。
[0011]本发明提及的间充质干细胞来源的外泌体，具有如下特征:直径约为50-100nm，具有脂质膜，内包裹蛋白质和mRNA、micr0RNA等遗传物质。⑵经蛋白分析含有⑶9、⑶81、Alix等蛋白分子，以及与间充质干细胞标记物一致的蛋白分子⑶44、⑶29。
[0012]本发明提及的间充质干细胞来源的外泌体(exosome)，由包括如下步骤的方法制备得到:
[0013](I)间充质干细胞的分离培养:
[0014]根据间充质干细胞来源不同，采用不同的分离培养方式:
[0015]①人脐带间充质干细胞的分离培养:取无菌新生儿新鲜脐带，经磷酸盐缓冲液(PBS)反复冲洗后，剪成直径约l_2mm的组织块；经2型胶原酶和胰酶消化依次后，将上清液离心，取细胞沉淀放入培养瓶，使用含10%胎牛血清DMEM/F12培养基，5% C02、37°C饱和湿度培养；去除非贴壁细胞，在贴壁细胞80%融合后0.25%胰蛋白酶消化进行传代培养；
[0016]②人胎盘间充质干细胞的分离培养:剪取胎盘绒毛膜面l-2cm厚的组织，剪成l-2mm的碎块，用磷酸盐缓冲液漂洗至无色，用Dispase II型酶和4型胶原酶37°C水浴消化I小时，振荡后静置，液体自然分为三层，吸取中间层悬液于离心管中，加入磷酸盐缓冲液混匀后离心，弃上清，取细胞沉淀放入培养瓶，使用含10%胎牛血清DMEM培养基，5% CO2,37°C饱和湿度培养；去除非贴壁细胞，在贴壁细胞80%融合后0.25%胰蛋白酶消化进行传代培养；
[0017]③人脂肪间充质干细胞的分离培养:无菌吸取脂肪抽提液，用磷酸盐缓冲液冲洗数次。去除吸脂手术中所用药物及血细胞，用I型胶原酶37°C消化I小时，间或搅拌；离心后弃去上层脂肪，混匀，用200目筛网过滤，将所获得的细胞悬液离心，细胞沉淀用磷酸盐缓冲液洗涤，用10%胎牛血清的a-MEM培养液悬浮，转移至培养瓶中，5% C02、37°C饱和湿度培养；在贴壁细胞80%融合后0.25%胰蛋白酶消化进行传代培养；
[0018](2)间充质干细胞条件培养基的收集:取3-5代的间充质干细胞无血清培养48h ;收集培养上清液；0.22 μ m无菌膜过滤得到间充质干细胞条件培养基；
[0019](3) exosome分离纯化包括:收集过滤的间充质干细胞条件培养基4°C，100g离心lOmin，收集上清；收集的上清液4°C，2000g离心20min，收集上清；收集的上清液4°C，1000g离心30min，收集上清；收集的上清液，I 1000g离心70min，弃上清，使用磷酸盐缓冲液重悬沉淀；再次IlOOOOg离心70min，弃上清，少量磷酸盐缓冲液重悬沉淀，0.22 μ m滤膜过滤除菌，得到间充质干细胞来源exosome。
[0020]将人脐带间充质干细胞来源的exosome用于治疗眼科疾病模型的效果评价:(I)视觉电生理检查；(2)临床观察及评分；(3)视网膜病理切片观察；(4)流式细胞术检测。
[0021]所述的眼科疾病模型包括：小鼠视网膜损伤模型、大鼠实验性自身免疫性葡萄膜视网膜炎模型、小鼠视网膜脱离模型。可模拟的眼科疾病包括：葡萄膜炎、视网膜脱离、视网膜变性以及其他各种原因导致的视网膜损伤和炎症。
[0022]利用人脐带间充质干细胞来源的exosome作为药物局部注射小鼠视网膜损伤模型、大鼠实验性自身免疫性葡萄膜视网膜炎模型、小鼠视网膜脱离模型，实验证明，exosome具有神经营养以及免疫抑制作用，能减轻各种原因导致的视网膜损伤、减轻炎症反应，从而改善视网膜功能，为临床治疗眼科疾病开辟新途径。
[0023]本发明所具有的有益效果：
[0024]本发明提供了间充质干细胞来源的外泌体（exosome)在制备治疗眼科疾病药物中的应用。exosome具有神经营养以及免疫抑制作用，能减轻各种原因导致的视网膜损伤、减轻炎症反应，从而改善视网膜功能，为临床治疗眼科疾病开辟新途径。
【附图说明】
[0025]图1扫描电镜下观察exosome，可见exosome直径约为50?100nm，有完整的脂质膜，小体中心呈低电子密度成分，圆形或椭圆形的膜性囊泡结