一种高稳定性的豆蔻精油纳米脂质体抗菌剂及其制备方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于抗菌剂及药物制剂或者化妆品领域，具体涉及一种高稳定性的豆蔻精 油纳米脂质体抗菌剂的制备及其制备方法。
【背景技术】
[0002] 豆蔻，多年生常绿草本植物，是姜科植物，产出暖性精油。精油无色或黄色，甜而温 暖，主要成分是松油醇，桉油醇，姜烯和柠檬烯；肉豆蔻含挥发油、脂肪油、苯丙素、木脂素和 黄酮等多种化学成分，具有抗菌消炎、镇痛、止泻、抗肿瘤等广泛的药理作用'豆蔻精油有良 好的抗炎，镇痛，抑菌作用，对各种食源性病原菌有较好的抗菌效果，且安全、无毒副作用， 在肉制品加工中应用广泛，可去异味，抑细菌，增辛香。
[0003] 国内有很多关于豆蔻在医学应用的专利申请；CN103893226A公开了肉豆蔻提取 物在制备抗痛风的药物、食品或保健品的应用，CN102988333A公开了豆蔻明在制备防治 肠炎的药物或食品中的应用，CN102036662A公开了一种利用肉豆蔻衣木脂素预防和治疗 ppAR介导的疾病的方法，CN103719464A发明了一种肉豆蔻脾胃虚弱保健茶，CN1709467A公 开了一种复方草豆蔻滴丸及其制备方法，CN101508937A公开了一种超临界二氧化碳提取肉 ?蔑精油的方法，可以获得尚品质的肉?適精油广品，CN103638074A公开了一种肉?適挥 发油在制备治疗抑郁症药物中的应用。
[0004] 虽然豆蔻精油在医学，食品和化妆品行业被广泛应用，具有较好的杀菌、增香等特 点，但是豆蔻精油易挥发，暴露在空气中不稳定，所以要寻找有效地方法降低豆蔻精油在使 用过程中的挥发程度，延长保存期。
[0005] 纳米脂质体能将豆蔻精油包裹在内，并且纳米脂质体不会对豆蔻精油的主要活性 成分造成破坏，纳米脂质体使豆蔻精油中的活性成分与外界环境隔绝开来，可以降低豆蔻 精油挥发性，延长保存期，但由于脂质体的缓释作用，包裹精油的脂质体保质期受限，所以， 选用壳聚糖和明胶制成稳定性高的多层脂质体，此外，纳米脂质体由于它们的亚细胞尺寸， 能加强脂质体的被动吸收机制，减少物质运输阻力，从而增强精油的抗菌等效果。
【发明内容】
[0006] 本发明的目的是公开一种高稳定性的豆蔻精油纳米脂质体及其制备方法，通过将 豆蔻精油包裹在多层纳米脂质体中，以实现减少豆蔻精油在使用过程中的挥发，从而减少 豆蔻精油的浪费，达到长效抗菌与高效利用的目的。
[0007] -种高稳定性的豆蔻精油纳米脂质体，豆蔻精油包裹在磷脂双分子层中，其特征 在于：磷脂双分子层为第一层纳米脂质体，还设有第二层纳米脂质体，第二层由壳聚糖组 成。
[0008] 进一步地，所述的一种高稳定性的豆蔻精油纳米脂质体，其特征在于：还设有第三 层纳米脂质体，第三层由明胶组成。
[0009] 进一步地，第二层纳米脂质体中壳聚糖的浓度为0· 2 mg/mL。
[0010] 进一步地，第三层纳米脂质体中明胶的浓度为0. 4 mg/mL。
[0011] 本发明由豆蔻精油，大豆卵磷脂，胆固醇、表面活性剂，壳聚糖和明胶制成豆蔻精 油纳米脂质体。
[0012] 大豆卵磷脂、胆固醇是构成脂质体的组要成分，胆固醇均有调节膜流动性的作用， 所以考察其两者的配比变化，对构成的脂质体分散性等参数有无影响；表面活性剂是增加 脂质体稳定性；豆蔻精油浓度是根据包封率来确定的；醋酸盐溶液的pH是为了最佳溶解壳 聚糖；壳聚糖和明胶可以增加稳定性。
[0013] 本发明的制备方法是将豆蔻精油，大豆卵磷脂，胆固醇混合于有机溶剂，减压蒸干 形成光滑的薄膜，加入水相介质和表面活性剂组成的混合溶液溶解薄膜并超声成乳、离心 后取上层液体过滤得到单层豆蔻精油纳米脂质体，其特征在于：将单层豆蔻精油纳米脂质 体与壳聚糖溶液搅拌均匀，通过离心和微孔滤膜过滤，得到粒径为纳米级的双层豆蔻精油 纳米脂质体。
[0014] 进一步地，将双层豆蔻精油纳米脂质体与明胶溶液搅拌均匀，通过离心和微孔滤 膜过滤，得到粒径为纳米级的多层豆蔻精油纳米脂质体。
[0015] 进一步地，本发明的大豆卵磷脂和胆固醇的质量比例为5:1 ;表面活性剂、豆蔻精 油与胆固醇的质量比为：1:4:4,此条件下可以得到最高的包封率。
[0016] 进一步地，表面活性剂为PVP，混合溶液中PVP的浓度为1. 0 mg/mL。
[0017] 单层豆蔻精油纳米脂质体与壳聚糖溶液的体积比为1:10 ;双层豆蔻精油纳米脂 质体与明胶溶液的体积比为1:10。
[0018] 本发明中所述的有机溶剂是氯仿。
[0019] 本发明中所用的水相介质是根据中国药典2000版标准配制的醋酸盐缓冲溶液， pH 值 3. 5~4· 0。
[0020] 所述的壳聚糖溶液为壳聚糖的醋酸盐溶液，浓度为0.2 mg/mL，醋酸盐溶液是根 据中国药典2000版标准配制的醋酸盐缓冲溶液，pH值3. 5~4. 0,优选3. 6,能够最佳溶解壳 聚糖。
[0021] 所述明胶溶液为明胶的醋酸盐溶液，浓度为0. 4 mg/mL，醋酸盐溶液是根据中国药 典2000版标准配制的醋酸盐缓冲溶液，pH值3. 5~4. 0。
[0022] 本发明中脂质体的第一层是磷脂双分子层，即人工细胞膜层。
[0023] 本发明中脂质体的第二层由壳聚糖组成，浓度为0. 2 mg/mL。
[0024] 本发明中脂质体的第三层由明胶组成，浓度为0.4 mg/mL。
【附图说明】
[0025] 图1为豆蔻精油纳米脂质体的包封率。
[0026] 图2为豆蔻精油纳米脂质体的粒径与多分散系数roi。
[0027] 图3为多层豆蔻精油纳米脂质体荧光显微图。
[0028] 图4为多层豆蔻精油纳米脂质体原子力显微图。
[0029] 图5多层豆蔻精油纳米脂质体对大肠杆菌的抗菌性能。
[0030] 图6多层豆蔻精油纳米脂质体对金黄色葡萄球菌的抗菌性能。
[0031] 表1为豆蔻精油纳米脂质体的Zeta电位。
【具体实施方式】
[0032] 通过下面实例说明本发明的【具体实施方式】，但本发明的保护内容，不仅局限于此 实施例1多层豆蔻精油纳米脂质体的包封率 1实验材料 大豆卵磷脂；BR ;国药集团化学试剂有限公司。
[0033] 胆固醇；AR ;国药集团化学试剂有限公司。
[0034] 三氯甲烷；AR ;国药集团化学试剂有限公司。
[0035] 豆蔻精油；AR ;法国florihana精油。
[0036] PVP ;GR ;国药集团化学试剂有限公司。
[0037] 壳聚糖；BR ;国药集团化学试剂有限公司。
[0038] 明胶；BR ;国药集团化学试剂有限公司。
[0039] 2实验方法 1)单层豆蔻精油纳米脂质体的制备 ①称取1 g大豆卵磷脂，0.2 g胆固醇和200mg的豆蔻精油，加50 mL氯仿使其溶解。
[0040] ②在旋转蒸发仪中蒸发至溶剂蒸干，蒸发温度为10~30 °C，圆底烧瓶内壁会形成 光滑的薄膜；然后将所得产品放入真空干燥箱中，30 °C，真空状态下干燥24小时。
[0041] ③称取0. 05 g的PVP于50mL醋酸盐缓冲液中，超声波条件下扩散，然后将PVP的 醋酸盐缓冲液加入圆底烧瓶中超声波条件下进行水化。
[0042] ④将水化后的混合液于细胞超微粉碎仪中以工作10 S，间隙5 S的频率粉碎30 min〇
[0043] ⑤将所得产品进行离心，4000 rpm，15min，取上层液体。
[0044] ⑥将所得液体用0. 22 μ m滤膜进行过滤，得滤液，为单层豆蔻精油纳米脂质体。
[0045] 2)双层豆蔻精油纳米脂质体的制备 ①按照上述单层豆蔻精油纳米脂质体的制备方法，制备含200mg豆蔻精油的单层纳米 脂质体。
[0046] ②将单层豆蔻精油纳米脂质体分散在含0. 2 mg/mL壳聚糖的醋酸盐溶液中混合均 匀；单层豆蔻精油纳米脂质体与壳聚糖的醋酸盐溶液的体积比1 :1〇。
[0047] ③将所得混合液于细胞超微粉碎仪中以工作10 s，间隙5 s的频率粉碎30 min。
[0048] ④将所得产品进行离心，4000 rpm，15min，取上层液体。
[0049] ⑤将所得液体用0. 22 μ m滤膜进行过滤，得滤液，为双层豆蔻精油纳米脂质体。
[0050] 3)多层豆蔻精油纳米脂质体的制备 ①按照上述双层豆蔻精油纳米脂质体的制备方法，制备含200mg豆蔻精油的双层纳米 脂质体。
[0051] ②将双层豆蔻精油纳米脂质体分散在含0. 4 mg/mL明胶的醋酸盐溶液中使其混合 均匀；双层豆蔻精油纳米脂质体与明胶的醋酸盐溶液的体积比为1 :1〇。
[0052] ③将所得混合液于细胞超微粉碎仪中以工作10 s，间隙5 s的频率粉碎30 min。
[0053] ④将所得产品进行离心，4000 rpm，15min，取上层液体。
[0054] ⑤将所得液体用0. 22 μ m滤膜进行过滤，得滤液，为多层豆蔻精油纳米脂质体。
[0055] 4)包封率的测定 用无水乙醇稀释豆蔻精油，逐级稀释成浓度分别为0. l、〇. 2、0. 4、0. 6、0. 8 mg/mL的标 准溶液；然后，分别吸取1 μ L标准溶液进行GC-MS分析，对其主要成分桧烯的谱峰面积进 行自动积分，绘制桧烯峰面积-豆蔻精油浓度标准曲线；首先取lmL豆蔻精油纳米脂质体样 品，13500 rpm，离心3 h，倒掉上清液。接着加入1 mL乙醇破乳剂，超声3 h，最后以10000 rpm的转速离心15 min，取上清液，用于GC-MS分析。制备好的脂质体样品，对精油主成分 的峰面进行自动积分，再根据步骤1中绘制的标准曲线，计算出脂质体中植物精油的含量。
[0056] 贝丨J :
[0057] 3豆蔻精油纳米脂质体的包封率 包封率是评价脂质体制剂质量好坏的最重要的指标，也是脂质体能否发挥较普通制 剂尚效、低毒等特点的关键；由图1可看出，单层?蔑精油纳米脂质体的包封率为21. 3%， 双层?蔑精油纳米脂质体的包封率为45. 8%，多层?蔑精油纳米脂质体的包封率最大，为 93. 1%，因此制备多层豆