汉黄芩素在治疗急性肾损伤中的用途及其制备的治疗急性肾损伤药物的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于药物工业领域，涉及汉黄芩素的医药新用途，具体涉及汉黄芩素在治 疗急性肾损伤时的用途。
【背景技术】
[0002] 急性肾损伤（Acute Kidney Injury, AKI)是临床常见危重疾病，可导致肾脏不完 全修复、持续慢性炎症和进展性纤维化，是引起继发性慢性肾脏病、肾衰竭及住院患者死亡 的重要原因。迄今为止AKI尚无任何有效治疗措施，因此，寻找可以减轻组织损伤、促进修 复、防止慢性纤维化发生的肾脏保护药物具有重要意义。
[0003] 汉黄苳素（Wogonin)是从唇形科植物黄苳、半枝莲及夹竹桃科植物鳝藤等植物中 分离得到的一种重要的黄酮类化合物，它主要存在于以上植物的根和茎中。以往研究结果 显示，汉黄芩素具有广泛的生物活性，如抗炎、抗氧化、抗肿瘤、抗病毒及神经保护作用等， 其中抗肿瘤活性是目前国、内外研究的热点之一，但其防治急性肾损伤时的药理学作用尚 未报道。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的在于提供汉黄芩素新的药物用途，具体涉及汉黄芩素在防治急性肾 损伤时的用途。
[0005] -种汉黄苳素，分子式为C16H1205，其化学结构式如下：
[0007] 其作为防治急性肾损伤药物的应用。
[0008] 所述的汉黄芩素制备的治疗急性肾损伤药物，其特征在于：该药物由所述的汉黄 芩素以及药学上可接受的辅助剂制得。
[0009] 所述的利用汉黄芩素制备的治疗急性肾损伤药物，其特征在于其剂型为注射剂、 片剂、丸剂、胶囊、悬浮剂或乳剂。
[0010] 本发明的有益效果为：实验结果证实汉黄芩素可有效减轻急性肾损伤，保护肾功 能，其作用机制与汉黄芩素降低炎症因子水平有关，应用前景广泛。
【附图说明】
[0011] 图1汉黄芩素（wog)减轻体外实验中顺铂（Cisplatin)引起的肾小管上皮细胞损 伤。如图（a) :MTT结果表明汉黄芩素明显减轻顺铂对HK2细胞的生长抑制作用；图（b): Western Blot及半定量分析结果显示汉黄芩素可抑制顺铂刺激的肾脏损伤分子（IQM-1) 的蛋白表达水平。
[0012] 图2汉黄芩素（wog)抑制体外实验中顺铂（Cisplatin)诱导的炎症因子水平。图 (a) :Real-time PCR结果表明汉黄芩素能明显降低顺铂诱导HK2细胞中TNF-α的mRNA水 平；图（b):汉黄芩素能明显降低顺铂诱导HK2细胞中IL-Ιβ的mRNA水平。
[0013] 图3汉黄芩素（wog)降低小鼠急性肾损伤模型中血肌酐和血尿素氮水平，提示其 对肾功能的保护作用。图（a):不同浓度的汉黄芩素可不同程度地降低小鼠急性肾损伤模 型中血肌酐的含量；图（b):汉黄芩素降低小鼠急性肾损伤模型中血尿素氮的含量。
[0014] 图4汉黄芩素（wog)降低小鼠急性肾损伤模型肾脏组织中的炎症因子水平。图 (a) :Real-time PCR结果显示汉黄芩素能明显降低小鼠急性肾损伤模型中TNF- a mRNA水 平；图（b):汉黄芩素明显降低小鼠急性肾损伤模型中E-li3mRNA水平。
【具体实施方式】
[0015] 实施案例1 :汉黄芩素在体外对顺铂诱发肾小管上皮细胞损伤的保护作用；
[0016] MTT法：将人肾小管上皮细胞（HK2)细胞接种于96孔板中，接种密度约为 4000个细胞/孔。培养24h，换用无血清培养基饥饿12小时后，分组加入顺铂和汉黄芩 素，分别为正常组（NC)、模型组（Cisplatin 3.0μg/ml)、汉黄芩素低剂量（Cisplatin 3. 0 μ g/ml+WogO. 625 μ g/ml)、中剂量（Cisplatin 3. 0 μ g/ml+Wogl. 25 μ g/ml)、高剂量组 (Cisplatin 3. 0 μ g/ml+Wog2. 5 μ g/ml)，继续培养 24h。培养结束后每孔加入 5g，L 1 的 MTT 溶液20 μ L，继续培育4h。吸去培养基，每孔加入150 μ L的DMS0,振荡，混匀。用酶标仪在 492nm处测定各孔0D值，记录结果。以细胞存活率（Cell viability)对剂量作图。结果计 算：细胞存活率=(试验组细胞0D值-空白组细胞0D值）八对照组细胞00值-空白组细 胞 0D 值）X100%。
[0017] Western Blot :将对数生长期的HK2细胞接种于6孔板中，分别分为正常组（NC)、 模型组（Cisplatin 3.0μg/ml)和汉黄苳素组（Cisplatin 3.0以8/1111+1〇82.5以8/1111)，每 组重复3-4次实验。接种密度约为1. OX 105个细胞/ml，孵育24小时用无血清培养基饥饿 12小时后分别加入刺激及药物。继续培养24小时。PBS洗三遍，收集细胞，提取总蛋白，通 过Western Blot法检测肾脏损伤分子KIM-1的蛋白表达并进行半定量分析。
[0018] 实验结果如图1中图（a)，即MTT结果显示，顺铂刺激的HK2细胞经过低、中、 高浓度的汉黄芩素处理后，该细胞的相对存活率值从顺铂刺激组的46. 44%分别升高到 76. 72%、68. 12%和84. 32%，存活率增加约1. 8倍。说明汉黄芩素对顺铂刺激的肾小管上 皮细胞具有较好的保护作用。
[0019] 图（b)即Western Blot及半定量分析结果显示，顺钼刺激的HK2细胞经过汉黄苳 素处理后，肾脏损伤分子MM-1的蛋白表达水平明显受到抑制，证明汉黄芩素对顺铂引起 肾小管上皮损伤的保护作用。
[0020] 实施案例2 :汉黄芩素对体外顺铂诱导炎症因子的抑制作用；
[0021] 将HK2细胞接种于12孔板中，分别分为正常组（NC)、模型组（Cisplatin3. 0 μ g/ ml)和汉黄苳素组（Cisplatin 3. 0 μ g/ml+Wog2. 5 μ g/ml)，每组重复3-4次实验。接种密 度约为0. 5 X 105个细胞/孔，孵育24小时用无血清培养基饥饿12小时后分别加入刺激及 药物。继续培养24小时。PBS洗三遍，收集细胞，提RNA，逆转录，扩增。
[0022] Real time PCR结果如图2中图（a)，顺铂明显诱导肾小管上皮细胞中TNF-amRNA 水平的升高，而汉黄芩素处理组TNF-a mRNA表达明显被抑制，图（b)结果显示肾小管上皮 细胞受到顺铂刺激后经汉黄芩素处理，其IL-1 β mRNA表达明显下降，提示汉黄芩素可显著 抑制顺铂诱发的炎症反应。
[0023] 实施案例3 :汉黄芩素对急性肾损伤模型中血肌酐（Creatinine)和血尿素氮 (BUN)的影响。
[0024] 将6-8周龄C57BL/6小鼠适应性培养1-2天，分为正常对照组（NC)、模型组 (Cisplatin 20mg/kg)、汉黄苳素低剂量组（Cisplatin 20mg/kg+Wog 12.5mg/kg)、中剂量 组（Cisplatin 20mg/kg+Wog 25mg/kg)、高剂量组（Cisplatin 20mg/kg+Wog50mg/kg)，每 组6-10只。小鼠腹腔注射20mg/kg顺铂建立急性肾损伤模型并注射低、中、高剂量的汉黄 芩素进行药物干预，3天后麻醉状态下收取血清样本及肾组织，并根据血肌酐和尿素氮试剂 盒说明书检测动物模型血清中肌酐和尿素氮的含量（购自南京建成生物工程研究所），
[0025] 肌酐测试
[0027] 肌酐含量（μ mol/L)=[(测定A2-K*测定A1)-(空白A2-K*空白Al)]/[(标准 A2-K*标准A1)-(空白A2-K*空白）]*标准品浓度（442 μ mol/L)
[0028] 注：稀释因子K =(加样量+酶溶液A体积V (加样量+酶溶液A体积+酶溶液 B 体积）=186/246
[0029] 尿素氮测试
[0030]
[0031 ] 尿素氮含量（mmol/L)=(测定0D值-空白测定值）八标准00值-空白00值）* 标准浓度（10mm〇l/L)*样本测试前稀释倍数
[0032] 实验结果如图3中图（a)显示，顺铂诱导模型组中血肌酐含量明显升高，肾功能恶 化，而不同浓度的汉黄芩素有效降低模型组血肌酐水平，图（b)结果同样显示不同浓度的 汉黄芩素有效降低模型组尿素水平，进一步证实汉黄芩素对急性肾损伤时肾功能具有保护 作用。
[0033] 实施案例4 :汉黄芩素对急性肾损伤模型中炎症的抑制作用；
[0034] 将6-8周龄C57BL/6小鼠适应性培养1-2天，分为正常对照组（NC)、模型组 (Cisplatin 20mg/kg)、汉黄苳素低剂量组（Cisplatin 20mg/kg+Wog 12.5mg/kg)、中剂量 组（Cisplatin 20mg/kg+Wog 25mg/kg)、高剂量组（Cisplatin 20mg/kg+Wog50mg/kg)，每 组6-10只。小鼠腹腔注射20mg/kg顺铂建立急性肾损伤模型并注射低、中、高剂量的汉黄 芩素，3天后麻醉状态下收取血样及肾组织，提取组织RNA，逆转录，扩增。
[0035] Real-time PCR结果如图4中图（a)，急性肾损伤模型中炎症因子TNF- a mRNA水 平显著上升，而汉黄芩素可明显降低炎症因子水平，改善炎症，图（b)结果同样显示，汉黄 芩素可降低顺铂引起的模型组肾脏IL-1 β mRNA高表达，这可能是汉黄芩素保护急性肾损 伤的作用机制之一。
【主权项】
1. 一种汉黄苳素，分子式为C16H1205，其化学结构式如下：其作为防治急性肾损伤药物的应用。2. -种利用如权利要求1所述的汉黄芩素制备的治疗急性肾损伤药物，其特征在于： 该药物由所述的汉黄芩素以及药学上可接受的辅助剂制得。3. 根据权利要求2所述的利用汉黄芩素制备的治疗急性肾损伤药物，其特征在于其剂 型为注射剂、片剂、丸剂、胶囊、悬浮剂或乳剂。
【专利摘要】，涉及汉黄芩素的医药新用途，具体涉及汉黄芩素有效降低急性肾损伤所引起的炎症反应，进而发挥肾脏保护作用。
【IPC分类】A61K31/352, A61P13/12
【公开号】CN105287488
【申请号】CN201510665468
【发明人】孟晓明, 李俊, 李增, 李海迪, 吴伟锋, 任桂灵, 高丽, 黄成 , 张磊, 徐涛, 李小枫, 马陶陶, 黄艳
【申请人】安徽医科大学
【公开日】2016年2月3日
【申请日】2015年10月12日