一种槲皮素类趋化因子受体拮抗剂的抗炎用图
【技术领域】
[0001] 本发明涉及槲皮素对趋化因子受体2b拮抗剂的抗炎用途。
【背景技术】
[0002] 趋化因子（chemokines)是指具有趋化作用的细胞因子，属于小分子的分泌蛋白 超家族（约8-10KDa，含70-90个氨基酸）。它在很多种疾病的病理生理过程中起着重要作 用，如多发性硬化、类风湿性关节炎、器官移植排斥、心脑血管疾病、肿瘤以及HIV等。趋化 因子通过与受体结合，在某种程度上促进了各种炎症性疾病以及各种自身免疫性疾病的发 生和发展。因而通过抑制趋化因子与其受体结合可在一定程度上抑制相关疾病的发生。趋 化因子受体拮抗剂的研究已经成为当前新药研究的热点课题之一。
[0003] 趋化因子受体2b (CCR2b)是单核细胞趋化蛋白-1 (Monocyte Chemoattractant Protein-1，MCP-1)的受体，MCP-1是重要的趋化类炎症因子，在炎症、风湿性关节炎、多发 性硬化、动脉粥样硬化、肺纤维化等多种疾病的发生和发展过程中起着关键作用。因此筛选 趋化因子受体2b拮抗剂在一定程度上对研究以上疾病的发病机制及治疗有一定的意义。
【发明内容】
[0004] 为了开发趋化因子受体2b拮抗剂从而为炎症的治疗寻找新的候选药物，本发明 在采用趋化因子受体2b拮抗剂高通量筛选模型，通过功能性验证寻找先导化合物，发现了 一类雷公藤三萜酸C类趋化因子受体2b拮抗剂，为新型的抗炎药开发提供先导化合物。本 发明可为此类临床炎症治疗药物的开发提供先导化合物，为新型抗炎药物开发提供线索和 实验依据。
[0005] 本发明的技术方案为：在中国仓鼠卵巢癌细胞（CH0)内稳定转染趋化因子受体 2b，建立趋化因子受体2b诘抗剂祀向激动剂高通量筛选模型，初筛，复筛，得到一类具有抗 炎作用的候选药物。具体步骤如下：
[0006] 步骤一：建立及培养稳定转染趋化因子受体2b的CH0细胞株。
[0007] 步骤二：激动剂模型建立及阳性药验证，确定激动剂的ECS。。
[0008] 步骤三：拮抗剂模型建立及阳性性药验证。
[0009] 步骤四：采用稳转细胞株和实验确定的最佳检测条件对化合物进行趋化因子受体 2b拮抗剂的高通量筛选，得到有明显量效关系的化合物。
【附图说明】：
[0010] 图1 :激动剂对照量效关系
[0011] 图2 :诘抗剂对照量效曲线
[0012] 图3 :先导化合物量效曲线
【具体实施方式】
[0013] 以下结合【附图说明】本发明的【具体实施方式】：
[0014] 1.实验材料：
[0015] (1)完全培养：F12 ;10% FBS。
[0016] (2)选择培养：400 μ g/mL G418。
[0017] (3) Stimulation Buffer (SB):试剂盒自带。
[0018] (4)主要仪器：C02培养箱；384 孔板；Paradigm ? Detection Platform。
[0019] 2.建立及培养稳定转染趋化因子受体2b的CHO CCR2B细胞株。
[0020] 3.激动剂模型建立及阳性药验证，确定激动剂的ECS。：
[0021 ] (1)配制MCP-1梯度稀释液：确定最佳细胞数时需要用MCP-1对细胞进行刺激，所 以应首先将11494nM的MCP-1母液（使用含不低于0. 1 % BSA的PBS配制）用SB逐级稀释 为工作浓度的2倍。
[0022] (2)配制不同浓度的细胞稀释液：用SB将细胞分别稀释为4000〇cells/well、 30000cells/well 及 20000cells/well。
[0023] (3)加样：将3· (1)中稀释好的MCP-1溶液按每个浓度2个复孔，5 μ L每孔加入 384孔板中。接着向不同浓度的MCP-1溶液中加入3. (2)配制好的不同浓度的细胞稀释液 各5 μ L。将384孔板在500rpm下离心15s，使10 μ L试剂混合均匀以充分反应。为防止试 剂蒸发造成损失，将TopSeal-A膜贴于板面并将板放于室温下使之孵育60min。
[0024] (4)终止试剂：用 Lysis buffer(LB)将 IPl-d2 及 anti-IPl 稀释 33 倍，按 1 : 1 混勾后加入各孔，每孔10 μ L。将384孔板在500rpm下离心15s，使20 μ L试剂混合均勾以 充分反应。重新贴上TopSeal-A膜并将板放于室温下继续孵育60min。
[0025] (5)检测：孵育时间到达后，揭去TopSeal-A膜，将板放于设定好程序的 Paradigm?Detection Platform上检测。处理数据，确定最佳细胞数及MCP-1的ECS。。
[0026] 4.拮抗剂验证
[0027] (1) CCR2b拮抗剂BMS CCR2 22使用DMS0配制成0. 5mM储备液，用SB逐级稀释为 最终浓度的2倍。
[0028] (2)配制含最佳细胞数的溶液：用SB将细胞稀释为3. (5)中得到的最佳细胞浓 度。
[0029] (3)加样：将4· (1)中稀释好的BMS CCR2 22溶液按每个浓度2个复孔，2. 5 μ L每 孔加入384孔板中。将4. (2)配制的细胞溶液按每孔5 μ L加入384孔板中。将384孔板 在500rpm下离心15s，使7. 5 μ L试剂混合均勾以充分反应。为防止试剂蒸发造成损失，将 TopSeal-A膜贴于板面并将板放于室温下使之孵育60min。
[0030] (4)将MCP-1母液稀释成3. (5)中测定的ECS。，每孔2. 5 μ 1加入对应的含BMS CCR2 22的384孔板中。将384孔板在500rpm下离心lmin，使10 μ L试剂混合均匀以充分反应。 为防止试剂蒸发造成损失，将TopSeal-A膜贴于板面并将板放于37°C /5% C02下使之孵育 60min〇
[0031] (5)按3.⑷配制终止试剂。向每孔加入10yL IPl-d2/anti-IPl溶液（1 : 1)。 将384孔板在500rpm下离心15s，使20 μ L试剂混合均匀以充分反应。重新贴上TopSeal-A 膜并将板放于室温下继续孵育60min。
[0032] (6)孵育时间到达后，揭去TopSeal-A膜，将板放于设定好程序的Paradigm? Detection Platform上检测。处理数据，确定诘抗剂的IC5。。
[0033] 5.采用摸索的最佳检测条件在稳转细胞中对趋化因子受体2b拮抗剂进行初筛与 复筛。处理数据，计算所筛选化合物IC5。。
[0034] 趋化因子受体2b受体活性筛选实验结果
[0035] 筛选得到的趋化因子受体2b拮抗剂为槲皮素类化合物，其结构式与IC5。如下：
[0037] 先导化合物对趋化因子受体2b拮抗活性：
【主权项】
1. 式（I)的化合物或其药学上可以接受的盐在趋化因子受体2b拮抗剂的用途；2. 按照权利要求1的用途，作为趋化因子受体2b拮抗剂，用于治疗炎症的用途。
【专利摘要】本发明涉及式(I)的趋化因子受体2b拮抗剂或其药学上可接受的盐。此类化合物可以拮抗趋化因子受体2b，有效地产生抗炎作用。
【IPC分类】A61K31/352, A61P29/00
【公开号】CN105287493
【申请号】CN201510828306
【发明人】严明, 汪豪, 高鹏, 张陆勇
【申请人】中国药科大学
【公开日】2016年2月3日
【申请日】2015年11月20日