No累积降低铜绿假单胞菌侵袭力的方法、靶点及应用
【技术领域】
[0001]本发明属生物医药技术领域，涉及N0累积降低铜绿假单胞菌侵袭力的方法、靶点及应用。
【背景技术】
[0002]铜绿假单胞菌(ΡΑ0)是一种非常重要的机会致病菌，被认为是医院感染性疾病三大致死菌之一。在人体免疫力低下的情况例如患有慢性疾病的人群，器官移植的病人或大面积烧伤的病人等等，它能引起各种不同的急性或是慢性感染甚至导致死亡，特别是敏感患者免疫系统和囊性纤维化(CF):超过80%的CF患者死于这些感染。铜绿假单胞菌对大部分的抗生素(头孢菌素、青霉素、氟喹诺酮类原料药和氨基糖甙类的抗生素)都有强的抗药性。目前临床应用的抗生素其作用靶点仅限于蛋白合成、细胞壁、DNA复制、细胞膜和叶酸辅酶等等，数量极为有限，而且存在严重的耐药性问题。细菌的侵袭力是其感染宿主并导致疾病的能力，而细菌的侵袭力取决于细菌所产生的毒性因子及其损伤宿主的作用机制。病原菌通过释放多种毒素类蛋白破坏宿主细胞的正常生理功能，甚至导致宿主细胞的死亡。近年来研究发现将细菌的侵袭力作为靶点来开发新型抗生素，可以通过抑制细菌致病性从而达到治疗细菌感染类疾病的目的，而且由于其对细菌的生长不产生影响，因此可以较少或者避免传统抗生素所引起的细菌耐药性问题的出现。
[0003]绿脓菌素(PCN)是铜绿假单胞菌一种重要的侵袭力因子。PCN是一种易穿透生物膜的蓝色吩嗪化合物，常见于CF患者感染铜绿假单胞菌的痰液中。最近动物模型实验结果显示，PCN是铜绿假单胞菌侵染过程中的关键化合物，其所具有的毒力能显著的减少靶点所侵染组织器官中的细胞，同时PCN还能抑制呼吸道上皮细胞的纤毛蠕动，并增加胞内过氧化物产生。目前已经报道一些化合物能够不同程度抑制铜绿假单胞菌绿脓菌素的合成，如儿茶素(2?4mM)能够减少50% PCN的合成；丁子香酚(50?400 μπι)能够减少56% PCN的合成；云南白药(2.5g/l)能够减少76.5% PCN的合成。但这些化合物多存在用药量大、对PCN合成抑制效率不高的问题，并且其中很多本身就具有强的杀菌性，这样不仅会增加菌株的耐药性，而且会影响人体内正常菌群的生长，损害人体健康。
【发明内容】
[0004]本发明解决的问题在于提供一种N0累积降低铜绿假单胞菌侵袭力的方法、靶点及应用，从“降低细菌侵袭力”角度出发，寻找到了一种新的能有效抑制铜绿假单胞菌侵袭力因子的途径，相关药物靶点可应用于药物的制备。
[0005]本发明是通过以下技术方案来实现:
[0006]一种降低铜绿假单胞菌侵袭力的方法，在铜绿假单胞菌的生存或培养环境中，通过外源N0供体或内源N0代谢阻断的方式达到N0累积，以降低铜绿假单胞菌的侵袭力因子绿脓菌素的产生。
[0007]所述的外源N0供体包括能够直接或间接向铜绿假单胞菌提供N0的化合物，外源NO供体存在于铜绿假单胞菌的生存或培养环境中。
[0008]所述的内源N0代谢阻断的调控包括对N0代谢相关酶的抑制或、阻断或增强。
[0009]其特征在于，所述的内源N0代谢阻断是向铜绿假单胞菌中克隆入能够与N0代谢相关酶重组并使其功能缺失的质粒或载体；或者采用N0代谢相关酶的抑制剂，使其酶活降低或丧失，达到N0在铜绿假单胞菌中的积累；或者采用基因重组或使用激动剂使有利于内源N0产生的酶的增强，达到N0在铜绿假单胞菌中的积累。
[0010]一种能够促使铜绿假单胞菌侵袭力降低的靶点，所述的靶点包括铜绿假单胞菌胞内与N0代谢相关的基因位点、与N0代谢相关的酶；
[0011]与N0代谢相关的基因位点、与N0代谢相关的酶被抑制或激活后能够达到N0累积，降低铜绿假单胞菌的侵袭力因子绿脓菌素的产生。
[0012]在铜绿假单胞菌的生存或培养环境中通过外源N0供体或内源N0代谢阻断的方式达到N0累积，以降低铜绿假单胞菌的侵袭力因子绿脓菌素产生的应用。
[0013]N0供体化合物在制备降低铜绿假单胞菌的侵袭力的药物中的应用。
[0014]能够对铜绿假单胞菌N0代谢阻断的质粒、载体或化合物在制备降低铜绿假单胞菌的侵袭力的药物中的应用。
[0015]所述的应用包括:
[0016]以N0代谢的拮抗、抑制或阻断的方式实现N0代谢阻断的化合物在制备降低铜绿假单胞菌的侵袭力的药物中的应用；
[0017]以N0代谢途径中关键酶分子为作用靶点或重组靶点的酶、载体或化合物在制备降低铜绿假单胞菌的侵袭力的药物中的应用。
[0018]以铜绿假单胞菌的N0还原酶为作用靶点的药物或载体在制备降低铜绿假单胞菌的侵袭力的药物中的应用。
[0019]与现有技术相比，本发明具有以下有益的技术效果:
[0020]1)本发明提供了利用N0累积降低铜绿假单胞菌侵袭力的方法、靶点及应用，利用外源的微量N0供体或内源的N0聚集有效抑制铜绿假单胞菌侵袭力因子的生物合成，其中仅用微量的N0即可实现对铜绿假单胞菌PCN的显著抑制(60 μ M SNP处理，PCN合成减少82% )，具有高效的特点；这为治疗铜绿假单胞菌感染提供了一种可能的新方法以及一系列药物靶点。
[0021 ] 2)本发明中的N0下游代谢的关键酶Nor若被抑制将产生与外源N0供体相同抑制侵袭力的效果(缺失Nor的突变株相比野生株其PCN合成减少84% )，因此以N0为代表的N0代谢相关酶将是抑制N0累积，从而降低铜绿假单胞菌侵袭力的有效靶点，是一个有效的药物制备针对的靶点。
[0022]3)本发明涉及的N0供体，比如硝普钠(SNP)于1929年就开始用于临床，其本身就是一种传统的强效、速效血管扩张药，所以在安全性上没有问题。而且本发明进一步通过实验证实SNP与传统抗生素没有拮抗作用，鉴于其提供可促使N0累积从而降低铜绿假单胞菌侵袭力，扩展了 SNP的应用，使其可以与抗生素联合用进行铜绿假单胞菌抑制药物的制备。
[0023]4)本发明从“抗细菌侵染力”角度出发寻找新型抗菌物质。N0在其不抑菌、杀菌的前提下，可以抑制病原菌的侵染力，不会给细菌本身带来生存压力，可以较少或者避免耐药性的产生，因此利用N0累积进行抑制细菌感染类药物的制备，有助于解决临床上细菌耐药性带来的难题。
[0024]5)本发明用N0供体，或通过抑制铜绿假单胞菌N0代谢相关酶，作为抗细菌感染类疾病的方式，将不会像传统抗生素那样影响人体的正常微生物群体，而人体正常微生物群体对人体健康有着非常重要的作用。
【附图说明】
[0025]图1为N0供体SNP对PA01生长和PCN合成的影响；(其中A为不同浓度SNP对PA01生长的影响为不同浓度SNP对PA01产PCN的影响；C为不同浓度SNP对PA01产PCN的影响趋势图)
[0026]图2为60 μ M SNP对临床分离铜绿假单胞菌生长和PCN合成的影响；(A为60 μ ΜSNP对临床分离铜绿假单胞菌生长的影响；B为60 μ M SNP对临床分离铜绿假单胞菌PCN合成的影响)
[0027]图3为nor基因敲除及PCR和抗性检测；(A为nor基因的结构以及含有插入Gm抗性nor基因结构；B为Δ nor菌株的PCR验证；C为Δ nor菌株的抗性验证)
[0028]图4为一氧化氮还原酶Nor对PA01和PA515生长的影响；(A为PA01与其Δ nor突变株PAN1的生长差异；B为P515与其Δ nor突变株PAN515的生长差异；)
[0029]图5为一氧化氮还原酶Nor对PA01和PA515PCN合成的影响。(A为PA01与其Δ nor突变株PAN1的产PCN的差异为P515与其Δ nor突变株PAN515的产PCN的差异，C为提取的PCN比色比较)。
【具体实施方式】
[0030]下面结合具体的实施例对本发明做进一步的详细说明，所述是对本发明的解释而不是限定。
[0031]本发明提供一种降低铜绿假单胞菌侵袭力的方法，在铜绿假单胞菌的生存或培养环境中，通过外源N0供体或内源N0代谢调控的方式达到N0累积，以降低铜绿假单胞菌的