一种智能抗菌多肽涂层的制备方法
【技术领域】
[0001]本发明是一种智能抗菌多肽涂层的制备方法，涉及一种可用于生物医药等方面的材料制备方法，属于生物医用材料领域。
【背景技术】
[0002]微生物耐药性或抗药性增强等问题日渐突出，开发新的抗菌资源已成为研究者关注的焦点。抗菌多肽与传统抗生素、药物的作用机制不同，具有抗菌谱广、作用强时间短、不易产生耐药性等特点，受到越来越多的重视。
[0003]多数抗菌多肽主要通过作用于细菌的细胞质膜，破坏其完整性并产生穿孔现象，造成细菌细胞内容物溢出胞外而死亡。细菌细胞质膜外的磷脂层带有负电荷，而动植物或者人体细胞质膜外不带负电荷，因此当带正电荷的抗菌多肽与不同细胞接触时，会选择性地吸附到细菌表面而不破坏人体细胞。由于抗菌多肽的特殊作用机制，一般能在接触微生物2-3分钟内将其杀死，无论微生物是否处于生长期，都能够发挥快速杀菌的作用。然而，一些研究表明，固定在材料表面的抗菌多肽的抗菌活性明显低于游离状态的抗菌多肽。(Bagheri，M.；Beyermann, M.；Dathe, Μ., Antimicrob Agents Chemother2009, 53, 1132-1141.Cho, ff.M.；Joshi, B.P.；Cho, H.；Lee, Κ.H., B10rg Med ChemLett2007，17，5772-5776.)
[0004]因此，有必要构建在无菌情况下稳定、接触细菌时智能释放抗菌多肽的高效抗菌材料。
[0005]二硫键是一种广泛存在于人体的化学键，在体液循环和细胞外介质中能够稳定存在。当外界环境中存在还原性物质时，如二硫苏糖醇(DTT)、谷胱甘肽(GSH)等，二硫键则会断裂生成巯基基团。特别是，肿瘤细胞中GSH的浓度远远高于正常血液环境，二硫键更容易断裂。利用这一特点，含有二硫键的高分子材料常被用作构建氧化还原响应性的药物释放载体。Lee等制备了一系列二硫键交联的透明质酸纳米凝胶(HA nanogels)作为细胞内输送siRNA的肿瘤靶向载体，研究表明纳米凝胶有效的防止了包覆在其中的siRNA受细胞内酶的生物降解作用。在10mM GSH的环境中，凝胶内包覆的siRNA约在1小时内完全释放。(Lee, H.；Mok, H.；Lee, S.；0h, Y.K.；Park, T.G., J Control Release 2007, 119, 245-252.)Bae等以二甲亚砜为溶剂制备了巯基化肝素与聚乙二醇的纳米复合物，在还原环境下，纳米凝胶迅速瓦解并释放出自由的肝素分子，从而显著的抑制小鼠黑色素瘤细胞的增殖。(Bae, Κ.H.；Mok, H.；Park, T.G., B1materials 2008, 29, 3376-3383.)中国专利(申请号201510303980.7)公开了一种巯基/ 二硫键可控自交联透明质酸水凝胶的制备方法及其应用，利用巯基和二硫键之间的氧化还原特性，构建可控可注射式智能型水凝胶。
[0006]不过，鲜有研究关注到大多数革兰氏阴性细菌和部分革兰氏阳性细菌细胞的谷胱甘肽(GSH)水平也达到毫摩尔(mM)级。(Fahey, R.C.；Brown, ff.C.； Adams, ff.B.;Worsham，Μ.B.，J Bacter1l 1978，133，1126-1129.Smirnova, G.V.；Muzyka, N.G.；Ushakov, V.Y.；Tyulenev, A.V.；0ktyabrsky, 0.N., Research in Microb1logy2015，166，609-617.)除GSH外，细胞膜表面、溶酶体和内涵体部位的关联酶，如半胱氨酸和疏基还原酶等，也可以协助一■硫键断裂。这为本发明基于疏基/ 一■硫键构建具有氧化还原响应释放抗菌多肽功能材料提供了依据。
【发明内容】
[0007]技术问题:本发明的目的是提供一种具有氧化还原响应的智能抗菌多肽涂层的制备方法。对不同基底材料均适用的方法，应用范围广，表面巯基接枝率可控且高于其他接枝方法。
[0008]技术方案:本发明采用等离子体处理基底材料表面并接枝巯基、在氧化剂作用下与含巯基抗菌多肽反应，制备氧化还原响应的抗菌多肽涂层，是对不同基底材料通用的方法。
[0009]本发明的智能抗菌多肽涂层的制备方法具体依次包括下列步骤:
[0010]步骤1).将基底材料置于低温等离子体发生器主体腔室中，抽真空后通入氩气并加载电压和电流进行等离子体处理，处理功率为5-100瓦，处理时间为30秒-3分钟；
[0011]步骤2).将步骤1)处理后的基底材料迅速置于二硫醇的甲醇溶液中反应，得到表面含有疏基的基底材料；
[0012]步骤3).将步骤2)所得的表面含有疏基的基底材料与含疏基抗菌多妝在氧化剂作用下反应，形成二硫键；在基底材料上得到智能抗菌多肽涂层。
[0013]所述含巯基抗菌多肽的氨基酸序列为KRWWKffffRRC，IRWRIRVWVRRIC，KRWRIRVRVIRKC, KKWKIVVIKWKKC, WIVVIWRRKRRRC 中的一种。
[0014]所述二硫醇为1，6-己二硫醇，4，4’ - 二苯基二硫醇中的一种，其甲醇溶液的质量百分比浓度为0.005% -0.1%。
[0015]所述氧化剂为辣根过氧化物酶、过氧化氢、氯胺中的一种或多种。
[0016]该涂层在与细菌细胞接触后，基底材料表面二硫键断裂，还原释放含巯基抗菌多肽，对细菌具有智能识别和杀灭作用。
[0017]有益效果:本发明与现有技术相比，具有如下优点:
[0018]1.本发明采用等离子体处理基底材料表面并接枝巯基，是对不同基底材料均适用的方法，应用范围广，表面巯基接枝率可控且高于其他接枝方法。
[0019]2.本发明制备的具有氧化还原响应的智能抗菌多肽涂层，在无菌情况下稳定，接触细菌时在其细胞膜表面还原酶的作用下，还原释放含巯基抗菌多肽，待细菌细胞破裂后释放更多的谷胱甘肽，进一步还原释放含巯基抗菌多肽。该涂层可根据所接触的细菌量调节抗菌多肽的释放量。
[0020]3.本发明制备的智能抗菌多肽涂层，在接触细菌时还原释放出抗菌多肽，处于游离状态的抗菌多肽的抗菌活性高于共价固定在材料表面的同种抗菌多肽，可大大减少抗菌多肽的使用量。
[0021]4.本发明制备的智能抗菌多肽涂层，具有良好的生物相容性和生物降解性。
【具体实施方式】
[0022]将基底材料置于低温等离子体发生器主体腔室中，抽真空后通入氩气并加载电压和电流进行等离子体处理。处理后的基底材料迅速置于一定量二硫醇的甲醇溶液中反应。所得的表面含有疏基的基底材料与含疏基抗菌多妝在氧化剂作用下反应，形成一■硫键。
[0023]实施例1
[0024]聚乳酸纳米纤维膜材料置于低温等离子体发生器主体腔室中，抽真空后通入氩气，调节压力为10Pa，电极距离为50mm，气体流速为0.3L/s，加载电压和电流进行等离子体处理，处理功率为8瓦，处理时间为3分钟。处理后的聚乳酸纳米纤维膜材料迅速置于100mL质量百分比浓度为0.05%的4，4’ - 二苯基二硫醇的甲醇溶液中反应2小时。反应后的纳米纤维膜材料经甲醇充分浸洗后真空干燥。处理所得的表面含有巯基的聚乳酸纳米纤维膜材料与含巯基抗菌十三肽(氨基酸序列为KRWRIRVRVIRKC)在辣根过氧化物酶和过氧化氢作用下反应，得到表面以二硫键共价键合抗菌多肽的聚乳酸纳米纤维膜材料。
[0025]实施例2
[0026]钛片置于低温等离子体发生器主体腔室中，抽真空后通入氩气，调节压力为10Pa，电极距离为50mm，气体流速为0.3L/s，加载电压和电流进行等离子体处理，处理功率为20瓦，处理时间为1分钟。处理后的聚乳酸纳米纤维膜材料迅速置于10mL质量百分比浓度为
0.01%的4，4’-二苯基二硫醇的甲醇溶液中反应4小时。反应后的钛片经甲醇充分浸洗后真空干燥，与含巯基抗菌多肽(氨基酸序列为IRWRIRVWVRRIC)在辣根过氧化物酶和过氧化氢作用下反应，得到表面键合抗菌多肽的钛片。与细菌细胞接触时，钛片表面二硫键断裂，还原释放含巯基抗菌多肽，发挥杀菌作用。
[0027]实施例3
[0028]导尿管置于低温等离子体发生器主体腔室中，抽真空后通入氩气，调节压力为10Pa，电极距离为50mm，气体流速为0.3L/s，加载电压和电流进行等离子体处理，处理功率为20瓦，处理时间为3分钟。处理后的导尿管置于100mL质量百分比浓度为0.005%的4，4’- 二苯基二硫醇的甲醇溶液中反应2小时。反应后的导尿管经甲醇充分浸洗并真空干燥后，与含巯基抗菌多肽(氨基酸序列为KKWKIVVIKWKKC)在辣根过氧化物酶和过氧化氢作用下反应，得到表面键合抗菌多肽的导尿管。
[0029]实施例4
[0030]聚醚砜多孔纤维材料置于低温等离子体发生器主体腔室中，抽真空后通入氩气，调节压力为10Pa，电极距离为50mm，气体流速为0.3L/s，加载电压和电流进行等离子体处理，处理功率为50瓦，处理时间为30秒。处理后的聚醚砜多孔纤维材料置于20mL质量百分比浓度为0.005%的1，6-己二硫醇的甲醇溶液中反应4小时。反应后的聚醚砜多孔纤维材料经甲醇充分浸洗后真空干燥。处理所得的表面含有巯基的聚醚砜多孔纤维材料与含巯基抗菌多肽(氨基酸序列为WIVVIWRRKRRRC)在氧化剂氯胺T作用下反应，得到表面键合抗菌多肽的聚醚砜多孔纤维材料。
【主权项】
1.一种智能抗菌多肽涂层的制备方法，其特征在于:所述方法依次包括下列步骤: 步骤1).将基底材料置于低温等离子体发生器主体腔室中，抽真空后通入氩气并加载电压和电流进行等离子体处理，处理功率为5-100瓦，处理时间为30秒-3分钟； 步骤2).将步骤1)处理后的基底材料迅速置于二硫醇的甲醇溶液中反应，得到表面含有疏基的基底材料； 步骤3).将步骤2)所得的表面含有巯基的基底材料与含巯基抗菌多肽在氧化剂作用下反应，形成二硫键；在基底材料上得到智能抗菌多肽涂层。2.根据权利要求1所述的智能抗菌多肽涂层的制备方法，其特征在于所述含巯基抗菌多肽的氨基酸序列为 KRWWKffffRRC，IRWRIRVWVRRIC，KRWRIRVRVIRKC，KKWKIVVIKWKKC，WIVVIWRRKRRRC 中的一种。3.根据权利要求1所述的智能抗菌多肽涂层的制备方法，其特征在于所述二硫醇为1，6_己二硫醇，4，4’ - 二苯基二硫醇中的一种，其甲醇溶液的质量百分比浓度为.0.005% -0.1%4.根据权利要求1所述的智能抗菌多肽涂层的制备方法，其特征在于所述氧化剂为辣根过氧化物酶、过氧化氢、氯胺中的一种或多种。5.根据权利要求1所述的智能抗菌多肽涂层的制备方法，其特征在于该涂层在与细菌细胞接触后，基底材料表面二硫键断裂，还原释放含巯基抗菌多肽，对细菌具有智能识别和杀灭作用。
【专利摘要】本发明的一种智能抗菌多肽涂层的制备方法是一种对不同基底材料普遍适用的方法，包括以下步骤：首先，将基底材料置于低温等离子体发生器主体腔室中，抽真空后通入氩气并加载电压和电流进行等离子体处理。其次，将处理后的基底材料迅速置于一定量二硫醇的甲醇溶液中反应。然后，所得表面含有巯基的基底材料与含巯基抗菌多肽在氧化剂作用下反应，形成二硫键。该抗菌多肽涂层在与细菌细胞接触时，基底材料表面二硫键断裂，还原释放含巯基抗菌多肽，发挥杀菌作用。处于游离状态的抗菌多肽的抗菌活性高于共价固定在材料表面的同种抗菌多肽，可大大减少抗菌多肽的使用量。
【IPC分类】A61K38/08, A61P31/04, C09D5/14, A61K38/10
【公开号】CN105288584
【申请号】CN201510823695
【发明人】姚琛, 周宾, 王怡红, 温智理
【申请人】东南大学
【公开日】2016年2月3日
【申请日】2015年11月24日