一种包埋有凝血相关酶水凝胶微球的应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种水凝胶微球的应用，特别是一种包埋有凝血相关酶的水凝胶微球 在血液凝固中的应用。
【背景技术】
[0002] 目前公开的针对血液（或血浆）凝固的方法均是采用凝血相关酶的直接凝固，这 种方法仅适用于少量静态样品或比较细小的管路的凝结。但如果是直径很大的管腔体系， 且有正压推进的情况下，难以在短时间内实现流动态的血液（或血浆）的快速凝固以及目 标管腔的有效封堵。
【发明内容】
[0003] 针对上述问题，本发明将凝血酶的生化促凝活性与水凝胶微球的阻塞作用相结 合，提出一种包埋有凝血相关酶的水凝胶微球在凝血过程的应用。其特征在于：水凝胶微 球的主要成分是海藻酸盐材料，微球粒径100-1000微米，粒径均一（CV〈20 % )，含有凝血相 关酶的海藻酸钠水凝胶微球中凝血相关酶与海藻酸钠的质量比1:3-4:1，除水后凝血相关 酶的载药量在25% -80%，载有凝血相关酶的水凝胶微球用于下述三种情形之一或二种以 上；
[0004] A、含有纤维蛋白原液体于管路中流动过程的管路阻塞；
[0005] 或，B、含有纤维蛋白原液体于管路中流动过程的一个或二个以上管路开口端封 闭；
[0006] 或，C、含有纤维蛋白原液体的凝结。
[0007] 其中，所述含有纤维蛋白原的液体包括离体的血液或血浆。
[0008] 所述流动的含有纤维蛋白原液体管路的阻塞、开口端封闭及液体凝结包括物 理-化学的联合作用；
[0009] 物理作用包括微球的机械阻塞和水凝胶迅速吸水膨胀后加强阻塞封闭作用；化学 作用指凝血相关酶作用于纤维蛋白原引发液体凝固后带来的阻塞封闭及凝结效应。
[0010] 所述水凝胶微球尤其适用于在一定压力（60-150mmHg)存在的含有纤维蛋白原的 流动液体的管路阻塞、管路开口端封闭或液体凝结的情形之一或二种以上。
[0011] 所述水凝胶微球中的凝血相关酶，包括凝血酶或血凝酶中的一种或两种。
[0012] 所述海藻酸盐水凝胶微球中，海藻酸盐分子量10kDa-2000kDa，所述海藻酸盐包括 海藻酸钙盐或海藻酸钡盐中的一种或二种，也可同时包含或不包含海藻酸钠盐或钾盐中的 一种或二种。
[0013] 所述水凝胶微球的制备方法包括如下步骤：
[0014] A、配制浓度10_30g/L海藻酸钠溶液；
[0015] B、将凝血相关酶溶解到步骤A制备的海藻酸钠溶液中，凝血相关酶的浓度为 10-40g/L，即得含有凝血相关酶的海藻酸钠溶液；
[0016] C、配制凝胶浴水溶液，凝胶浴中含有总浓度5_30g/L氯化钙或氯化钡的一种或两 种，凝胶浴水溶液还含有总浓度l_20g/L氯化钠或氯化钾中的一种或二种；凝胶浴水溶液 还含有总浓度〇. 5-20g/L柠檬酸钠或磷酸钠或磷酸氢二钠或磷酸二氢钠中的一种或二种 以上；凝胶浴水溶液还含有总浓度l-30g/L吐温或F68中的一种或二种；
[0017] D、在高压静电场下，将步骤B配制的含有凝血相关酶的海藻酸钠溶液形成均匀的 射流液滴，液滴进入步骤C配制的凝胶浴溶液中，发生凝胶化反应，即得包埋有凝血相关酶 的海藻酸盐水凝胶微球。
[0018] 所述包埋有凝血相关酶的海藻酸盐水凝胶微球可进一步与聚阳离子溶液交联反 应，在微球表面形成聚电解质络合膜，形成包埋有凝血相关酶的海藻酸盐-聚阳离子微球， 具体步骤为：
[0019] 1)将包埋有凝血相关酶的海藻酸盐水凝胶微球投入到聚阳离子溶液中，微球与聚 阳离子溶液的体积比为1:2-1:10,旋转震荡，让微球在溶液中处于均匀悬浮状态，进行聚电 解质络合反应2-60分钟；
[0020] 2)微球与聚阳离子反应液分离，收集微球，生理盐水清洗后即获得包埋有凝血相 关酶的海藻酸盐-聚阳离子微球；
[0021] 其中，聚阳离子包括壳聚糖及其衍生物，α或ε聚赖氨酸，聚鸟氨酸、聚精氨酸， 聚胺及其衍生物、聚酰胺及其衍生物、聚酰亚胺及其衍生物，及上述任一一种或二种以上聚 阳离子的共聚物中的一种或二种以上，聚阳离子分子的分子量在lkDa-500kDa，聚阳离子溶 液浓度 〇· 2_20g/L。
[0022] 所述包埋有凝血相关酶的水凝胶微球可根据应用需求，实现凝血相关酶在应用环 境的缓控释。
[0023] 本发明的优点：
[0024] 1.载凝血酶的海藻酸盐水凝胶微球用于流动的含有纤维蛋白原液体管路的阻塞、 开口端封闭及液体凝结。较单纯凝胶微球或单纯凝血酶的作用效果相比，本发明发挥了水 凝胶微球的物理效应及凝血酶的化学效应相联合的作用。其中，物理效应包括微球的机械 阻塞和水凝胶迅速吸水膨胀后加强阻塞封闭作用；化学作用指凝血相关酶作用于纤维蛋白 原引发液体凝固后带来的阻塞封闭及凝结效应。因此，本发明中的载有凝血酶的海藻酸盐 水凝胶微球能够充分发挥对流动的含有纤维蛋白原液体管路的阻塞、开口端封闭及液体凝 结的应用效果。
[0025] 2.由于能够实现体外缓释。因此，将凝血酶的生化促凝血功能与海藻酸盐水凝胶 微球的物理阻塞作用相结合，实现在一定压力（60-150mmHg)存在的含有纤维蛋白原的流 动液体的管路阻塞、开口端封闭及液体凝结。
[0026] 3.本发明的工艺制备过程条件温和，易于凝血相关酶生物活性的保持。
[0027] 4.本发明采用的凝血相关酶包埋工艺，是在海藻酸盐水凝胶微球制备过程中直 接将凝血相关酶包埋进微球，凝血相关酶的包封率高达90%以上，除水后的载药量高到 25% -80%。
【附图说明】
[0028] 附图1 :新西兰大白兔肾动脉造模及微球栓塞影像；
[0029] A:正常肾脏影像；
[0030] B:肾脏血管损伤造模后影像（红色箭头所示为损伤后出血）；
[0031] C:利用微球栓塞受损动脉后影像，显示出血停止；
[0032] D:栓塞后lOmin复查血管造影显示无出血，凝血酶微球栓塞止血成功。
【具体实施方式】
[0033] 实施例1
[0034] 【1】配制海藻酸钠溶液（浓度15g/L);
[0035] 【2】将凝血酶（lOOmg)溶解到步骤【1】制备的海藻酸钠溶液中，浓度为10g/L，即 得含有凝血酶的海藻酸钠溶液；
[0036] 【3】配制凝胶浴溶液，凝胶浴中含有氯化钙（浓度30g/L)，氯化钠（浓度5g/L)，磷 酸二氢钠（浓度lg/L)，吐温5g/L ;
[0037] 【4】在高压静电场下，将步骤【2】配制的含有凝血酶的海藻酸钠溶液形成均匀的射 流液滴，液滴进入步骤【3】配制的凝胶浴溶液中，发生凝胶化反应，反应30分钟后即得包埋 有凝血酶的海藻酸盐水凝胶微球，微球粒径500± 100微米。
[0038] 【5】将步骤【4】制备的包埋有凝血酶的海藻酸盐水凝胶微球，与壳聚糖溶液（浓 度5g/L)常温下进行成膜反应10分钟，生理盐水洗涤3遍，即获得包埋有凝血酶的海藻酸 盐-壳聚糖微球。
[0039] 【6】配制纤维蛋白原溶液：取纤维蛋白原，加入0. 9 %氯化钠溶液制备成含lg/L的 溶液。
[0040] 【7】通过微加工技术制备一分二、二分四的三级分枝的管路，最后一级形成长lcm， 直径:φ =2mm的4条并联管路，管路末端开放，与储液池相连，并通过蠕动泵将储液池液体 重新泵回三级分枝管路中一级管路加样入口，形成循环回路。将步骤【6】配制的纤维蛋白 原溶液放在储液池中，即在蠕动泵作用下，以i〇ml/s的流速稳定通过三级流动管路。
[0041] 【8】将步骤【5】制备的包埋有凝血酶的海藻酸盐-壳聚糖微球通过毛细导管（内 径为1mm)导入三级流动管路最后一级距离开口端5mm处，向流动管路中放入0. 2ml微球， 取出导管，发现放有微球的导管在30秒钟后即发生血浆流体凝固，而未放置微球的管路， 仍然保持正常的流动状态。
[0042] 比较例1
[0043] 【1】配制纤维蛋白原溶液：取纤维蛋白原，加入0. 9 %氯化钠溶液制备成含lg/L的 溶液。
[0044] 【2】与实施例1相同方法加工成相同的三级分枝管路。
[0045] 【3】将与实施例1等量的凝血酶溶液通过毛细导管（内径为1mm)导入三级流动管 路最后一级距离开口端5_处，取出导管，发现30秒钟后各导管均未发生凝固反应，仍然保 持正常