功能化白蛋白及其纳米制剂的制备方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种功能化白蛋白及其纳米制剂的制备方法，属于纳米药物及传递载体技术领域。
【背景技术】
[0002]多药耐药(multidrug resistance，MDR)是指肿瘤细胞长期接触某一化疗物后可产生对此种化疗药物耐药性，而且可对其他结构和作用机制不同的多种化疗药物产生交叉耐药性。阿霉素(Doxorubicin)是乳腺癌化疗的常用药物，乳腺癌细胞对阿霉素产生耐药是阿霉素化疗失败的主要原因(Detwiler A, et al.，2013)，也是影响临床肿瘤患者预后的重要因素。现今逆转乳腺癌细胞耐药性的方法较少，目前研究发现MDR的有效抑制剂有维拉帕米、环孢素A、三苯氧胺、类固醇激素(Goncalves RS, et al., 2012; Zhang,et al.，2013; Zhang LH, et al.，2005)等，但这些耐药逆转剂干扰传统的抗癌药物药代动力学，且可引起严重的毒副作用等，至今都未取得预期的临床效果，因此在临床上被限制使用。
[0003]近年来纳米药物用于逆转肿瘤耐药性受到越来越多的重视，脂质体、高分子聚合物纳米载体、胶束等纳米制剂(X1ngXB, et al., 2005 ；Ling Peng, et al., 2015)已被用于逆转肿瘤耐药性的研究。其逆转原理为纳米制剂通过内吞作用进入肿瘤细胞内，通过响应性释放等性质将药物释放在胞质中，在很大程度上避开p-gp栗对游离抗肿瘤药物的外排作用，增加药物的摄取量，进而增强抑制肿瘤细胞增殖的效果。
[0004]pH响应性的药物释放系统是一类智能药物释放系统，它能根据所处环境的酸碱度对药物进行可控性的释放。人体的肿瘤胞外环境(pH 5.7-7.8)比正常血液或组织(pH约
7.4)显酸性，而且细胞内涵体和溶酶体的pH更分别低至5.0和4.5。该类新型纳米载体可通过胞吞途径携载药物进入肿瘤细胞内涵体，避免了 P-gp对药物的识别，而后内涵体的酸化(pH的改变)使其发生解聚或溶解，造成膜内外渗透压的变化，使内涵体快速地膨胀破裂，从而集中释放药物至胞浆，完成对肿瘤细胞的杀伤作用。因此，pH响应性的药物释放系统在生物医药等领域尤其是抗肿瘤领域具有广泛的应用前景。
[0005]本发明中使用内源性分子白蛋白及配位基团修饰(如组胺二盐酸盐等)，通过化学反应合成功能化白蛋白，不仅能够改变白蛋白的等电点至碱性，可使其在中性环境下形成较好的纳米颗粒；同时接枝的组胺能够提供咪唑基团，提高了载体的缓冲能力，重点是增加了能够与金属离子配位的基团。
【发明内容】
[0006]目的:为了克服现有技术中存在的不足，本发明提供一种功能化白蛋白，通过pH响应性金属配位键包载药物，无需有机溶剂及高压均质技术等方式实现纳米颗粒的制备，可以在水溶液中自组装形成纳米颗粒，材料的合成简单易行、纳米颗粒的制备绿色环保。
[0007]技术方案:为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案为: 一种功能化白蛋白，其特征在于:所述功能化白蛋白是通过化学反应将配位基团修饰到白蛋白游离基团上，使具有与金属离子配位的功能。
[0008]所用白蛋白，选自牛血清白蛋白(BSA)、人血清白蛋白(HSA)、重组人血清白蛋白、卵清蛋白、卵白蛋白、血清白蛋白、乳白蛋白、肌白蛋白、麦白蛋白、豆白蛋白；所修饰的配位基团选自胺基、咪唑基、胍基、羟基、巯基、羧基、磺酸基、磷酸基。
[0009]本发明还提供一种功能化白蛋白纳米制剂，由上述的功能化白蛋白、金属离子、药物组成；金属离子同时与功能化白蛋白和药物形成配位键，诱导自组装形成纳米颗粒。功能化白蛋白纳米制剂是将功能化白蛋白、金属离子和药物通过配位诱导的组装方式而形成的。
[0010]所述的功能化白蛋白纳米制剂的制备方法，包括以下步骤:
(1)首先将药物与金属盐按照配位比例为1:0.5-1:4进行混合，得药物与金属离子的配位复合物；
(2)在搅拌条件下，将药物与金属的配位复合物逐滴加入到1-5%(W/V)的功能化白蛋白水溶液中；
(3)使用0.1 M NaOH溶液调节pH至6.5-8.0，然后在0?50°C下搅拌0.5_12h ；
(4)使用截留分子量为3500-14000的透析袋在水中透析除去游离药物后，冷冻干燥即得。可用水复溶后使用；用于靶向输送药物。
[0011]所述的功能化白蛋白纳米制剂的制备方法，其特征在于:所述的金属盐为可溶性的锌盐、铁盐、铜盐、钴盐、锰盐、镍盐、镧盐、钆盐、银盐、锆盐、钛盐；选自硝酸锌，硝酸铁，硝酸铜，硝酸钴，硝酸锰，硝酸镍，硝酸镧，硝酸钆，硝酸银，硝酸锆，硝酸钛，氯化锌，氯化铁，氯化铜，氯化钴，氯化锰，氯化镍，氯化锆，氯化镧，氯化钆，氯化银，氯化锆，氯化钛，硫酸锌、硫酸铁、硫酸铜、硫酸钴、硫酸锰、硫酸镍、硫酸镧，硫酸钆，硫酸银，硫酸锆，硫酸钛中的一种或几种。
[0012]所述的功能化白蛋白纳米制剂的制备方法，其特征在于:所述药物为含有羟基、羰基、巯基、氨基、羧基、胍基、磺酸基或磷酸基的有机化合物。
[0013]作为更优选，所述药物为蒽环类药物或黄酮类药物。
[0014]作为优选方案，所述蒽环类药物包括盐酸柔红霉素、盐酸阿霉素、盐酸伊达比星、盐酸表阿霉素、盐酸阿柔比星、盐酸佐柔比星、吡柔比星、依索比星、卡柔比星、奈莫柔比星、戊柔比星、地托比星、罗多比星、美多比星、达佐霉素、丝裂霉素、博莱霉素、平阳霉素、米托蒽醌、茜素红、邻菲啰啉。
[0015]作为优选方案，所述黄酮类药物包括大黄素、黄芩素、黄芩苷、槲皮素、芦丁、陈皮素、甘草苷、水飞蓟素、儿茶素、银杏素、木犀草苷、木犀草素、葛根黄酮。
[0016]有益效果:本发明提供的功能化白蛋白与现有技术相比，具有以下优点:
该材料的合成方法简单，使用内源性分子白蛋白及含有配位基团的分子(如组胺二盐酸盐等)，通过化学反应合成功能化白蛋白，不仅能够改变白蛋白的等电点至碱性，可使其在中性环境下形成较好的纳米颗粒；同时接枝的组胺能够提供配位基团，提高了载体的缓冲能力，重点是增加了能够与金属离子配位的基团。该功能化白蛋白纳米制剂的制备方法简单易行，不使用有机溶剂，可使其在中性环境下在水溶液中形成较好的纳米颗粒，即将药物及功能化白蛋白通过金属配位键交联起来，并通过调节pH值至中性使其组装成纳米颗粒。本发明的自组装纳米颗粒能够通过内吞途径进入细胞，避开p-gp栗对药物的外排作用，并根据PH的细微变化进行可控的药物释放，实现对耐药肿瘤细胞的有效治疗。
【附图说明】
[0017]图1为实施例1中功能化白蛋白合成示意图。
[0018]图2为实施例4中合成的功能化白蛋白的表征:(A)元素分析，(B)SDS-PAGE凝胶电泳实验，(C)缓冲能力试验。
[0019]图3为实施例8中制备的纳米颗粒的表征:(A)荧光猝灭法证明BH与Fe3+可以配位，(B)、(C)分别为 ICP-MS 测定 D0X- Fe3+配合物中的 Fe 和 N，(D) D0X、BH_ Fe 3+、D0X_Fe3+及BH- Fe 3+_D0X纳米颗粒(NPs)的紫外吸收光谱，(E)BH- Fe3+-D0X纳米颗粒溶解在pH值为7.4、6.5、5.5、4.5的PBS及1M HC1中的紫外吸收光谱。
[0020]图4为实施例9中制备的纳米颗粒的响应性释放:(A) BH- Fe3+_D0X纳米颗粒在pH值为7.4、6.5、5.5、4.5的PBS中的累积释放曲线，(B)BH_ Fe3+_D0X纳米颗粒在pH 7.4的PBS及ImM的去铁胺(DF0)中的累积释放曲线。
[0021]图5为实施例10中制备的纳米颗粒在敏感及耐药乳腺癌细胞中不同药物浓度下不同时间的细胞毒性:(A) MCF-7，24h、(B) MCF-7/ADR，24h (C) MCF-7，72h、(D) MCF-7/ADR，72h0
[0022]图6为实施例10中制备的纳米颗粒在敏感及耐药乳腺癌细胞中的摄取研究:(A)在MCF-7、(B) MCF-7/ADR细胞上，对照相当量的游离药，给予不同浓度的纳米颗粒，观察不同时间段内的摄取量，(C)在MCF-7、MCF-7/ADR细胞中分别给予相当量药物浓度的游离药及纳米颗粒，孵育一定时间后对溶酶体及细胞核进行染色，共聚焦显微镜下观察摄取情况。
[0023]图7为实施例10中制备的纳米颗粒对耐药乳腺癌细胞株的细胞凋亡效果。
【具体实施方式】
[0024]下面结合附图和具体实施例对本发明作更进一步的说明。
[0025]实施例1
如图1所示，在搅拌条件下，将13.875g组胺二盐酸盐(HA)加入到50ml 50%(W/V)牛血清白蛋白(BSA)的中性磷酸盐缓冲溶液中，然后使用1M HC1溶液调节体系的pH值到4.75，最后加入4.5g 1-(3- 二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC.Η(:1)进行催化，室温搅拌反应6h。加入4M醋酸盐缓冲盐终止反应后使用截留分子量14000的透析袋在去离子水中透析3天；过滤，在-80 °C冷冻，干燥得到咪唑化白蛋白(BH)。
[0026]实施例2
在搅拌条件下，将17.2g硫酸胍基丁胺(Agm)加入到50ml 50% (W/V)人血清白蛋白(HSA)的中性磷酸盐缓冲溶液中，然后使用1M HC1溶液调节体系的pH值到4.75，最后加入
4.5g 1-(3- 二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC.HC1)进行催化，室温搅拌反应6h0加入4M醋酸盐缓冲盐终止反应后使用截留分子量14000的透析袋在去离子水中透析3天；过滤，在-80 V冷冻，干燥得到胍基化白蛋白(HSA-Agm)。
[0027]实施例3
在搅拌条件下，将15.252g精胺(SPE)加入到50ml 50% (W/V)人血清白蛋白(HSA)的中性磷酸盐缓冲溶液中，然后使用1M HC1溶液调节体系的pH值到4.75，最后加入4.5g1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDOHC1)进行催化，室温搅拌反应6h。加入4M醋酸盐缓冲盐终止反应后使用截留分子量14000的透析袋在去离子水中透析3天；过滤，在-80 V冷冻，干燥得到胍基化白蛋白(HSA-SPE)。
[0028]实施例4
如图2所示，BH的表征(元素分析、SDS-PAGE电泳实验、缓冲能力试验)
2.1首先利用元素分析仪测定BH中各元素(C、H、N)的含量，通过含氮量的变化计算组胺的接枝量，进而计算出BH的分子量。
[0029]2.2使用SDS-PAGE电泳证明接枝前后分子量发生变化，本试验根据分子筛原理，分子大小不同的蛋白质产生不同的迀移率，电泳后在不同的水平位置出现蛋白条带。具体操作如下:
2.2.1配制浓度为10%的SDS-PAGE凝胶电泳
2.2.2蛋白变性，称取浓度为lmg/ml为BSA及BH，加入相应量的上样缓冲液，在100°C沸水浴中煮沸5min。
[0030]2.2.3上样后电泳，分别加入5yL蛋白Marker、4yL BSA、4yL BH，然后在100V电压下进行电泳，2h后停止。
[0031]2.2.4使用去离子水清洗