液泡分选蛋白4a在制备防治肠道病毒71型感染药物中的应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及生物医学技术领域，是一种抗肠道病毒71型感染的新靶点及应用。
【背景技术】
[0002] 肠道病毒71型（enterovirus 71，EV71)属于小核糖核酸病毒科肠道病毒属人肠 道A类病毒，是导致手足口病（Hand-foot-mouth disease, HFMD)的主要病原体之一。目 前，手足口病在世界多个地区暴发并流行，尤其是亚太地区。在我国，自2008年几大省市 暴发手足口病疫情以来，该病的感染人数和死亡率一直居高不下，每年报告发病数超过100 万例，死亡数近1000例。手足口病主要发病人群为5岁以下婴幼儿，临床表现为发热，手、 足、臀部以及口腔粘膜等部位出现疱疹等症状；少数患儿可发展为重症患者，出现中枢神 经系统（central nervous system，CNS)病变，包括无菌性脑膜炎、脑干脑炎、脑脊髓炎以 及神经源性肺水肿等，严重威胁着婴幼儿的生命健康[Solomon T，Lewthwaite P，Perera D, Cardosa MJ, McMinn P, Ooi MH. Virology, epidemiology, pathogenesis, and control of enterovirus 71. Lancet Infect Dis.2010Nov;10(ll) :778-90.]。手足口病特别是重症病 例多由肠道病毒71型（EV71)感染所致。然而，目前关于EV71引起手足口病的治疗尚无特 异高效的抗病毒药物，临床上仍以对症治疗为主，在预防方面也无有效疫苗问世。
[0003] EV71的传播以粪-口途径最广，在此传播途径中，肠道是人体抵御病原体 的第一道屏障。动物实验研究证实，EV71经口腔接种小鼠后，最先在小肠组织表现 出病原体阳性[Chen YC, Yu CK, Wang Y F，et al. A murine oral enterovirus 71 infection model with central nervous system involvement. Journal of General Virology，2004, 85(1) :69-77]。因此，EV71首先通过对肠道系统进行感染，在小肠道细胞 内大量快速复制，随后入血导致病毒血症并引发其它器官的感染。然而，在EV71到达人体 肠道系统后，病毒如何侵入肠道细胞的机制尚不清楚。小肠作为人体消化系统重要器官，主 要负责营养物质的消化与吸收，其腔面最外层为小肠粘膜上皮细胞，对于抵御病原体的起 着至关重要的作用。作为人结肠癌细胞系，Caco-2在形态学和生理学功能方面与人小肠粘 膜上皮细胞相似，培养成熟的Caco-2为致密的单层细胞，具有与正常的小肠粘膜上皮细胞 相同的极性和紧密连接、微绒毛结构；且作为肿瘤细胞，比小肠粘膜上皮细胞更易培养。因 此，探明EV71感染Caco-2的机制并以此寻找新的抗病毒靶点，对于防治EV71对人体的感 染至关重要。
[0004] 为了有效地感染细胞，病毒必须利用宿主细胞的膜分子及其囊泡运输系统完成 对宿主细胞的入侵，才能在细胞内进行复制并释放出有感染性的子代病毒颗粒。因此， 作为病毒感染宿主细胞的首要环节，细胞入侵已成为抗病毒药物筛选的重要靶标。研究 表明，EV71可利用不同的宿主因子和感染途径来入侵不同种类的靶细胞，比如EV71借助 网格蛋白依赖的内吞途径（clathrin-mediated endocytosis)感染人横纹肌肉瘤细胞 (rhabdomyosarcoma, RD)[Yamayoshi, S. , et al. , Scavenger receptor B2 is a cellular receptor for enterovirus71.Nat Med，2009.15(7):p.798_801·];而感染 Jurkat T 淋巴细胞系则主要利用小窝依赖的内吞途径（caveolar-dependent endocytosis) [Lin HY，Yang YT，Yu SL，et al.Caveolar endocytosis is required for human PSGL-1-mediated enterovirus 71infection.J Virol. 2013, 87(16) :9064-76.]。目前，关 于EV71感染Caco-2的途径及机制仍不清楚。
[0005] 病毒侵入靶细胞主要借助了参与宿主细胞自身物质运输的关键分子，这些宿主细 胞膜转运分子在细胞的跨膜物质运输，囊泡的形成、内吞以及分泌中发挥着重要的作用。如 Rab5a、Rab5b、Rab5c介导了批网格蛋白衣被小泡从细胞质膜向早期内体的转运（Gorvel J P, Chavrier P, Zerial M，et al. rab5controls early endosome fusion in vitro. [J]. Cell，1991，64(5) :915-925.);网格蛋白（clathrin)主要负责受体介导的的内吞过程；小 窝蛋白家族分子 caveolin-l(CAVl)、caveolin_2(CAV2)、caveolin_3(CAV3)将物质运输 至高尔基体；Floti 11 in分子能够与脂後内蛋白分子相互作用并内吞入细胞内；ADP核糖 基化因子6分子参与调解细胞质膜运输和胞内肌动蛋白装配；GTP酶激活蛋白分子GRAF1 在网格蛋白非依赖型的囊泡运输中具有重要的调节作用；白细胞介素2受体内吞调节了 信号通路并影响了细胞增殖（Jason Mercer，Mario Schelhaas，et al.Virus Entry by Endocytosis. Annu Rev Biochem. 2010;79:803-833·)。在以上这些分子中，caveolin-1 和 clathrin被证实分别参与了 EV71感染Jurist T淋巴细胞和RD细胞的过程，而其它分子在 EV71感染中的作用还未有报道。
[0006] 液泡分选蛋白 4A (vacuolar protein sorting 4homolog A，VPS4A)由 VPS4A 基因编码，其另一同源蛋白为Vps4B，二者都属于ATP酶AAA蛋白成员，通过水解ATP 提供能量，与转运必需内体分选复合物（Endosomal Sorting Complex Required for Transport，ESCRT)第三成员ESCRT-III的相关蛋白相互作用，参与到细胞膜性结构 的变形和剪切过程中。其主要生物学功能包括多囊泡体的形成、胞质分离、病毒出芽 释放等（Henne WM，Buchkovich NJ，Emr SD. The ESCRT pathway. [J]· Developmental Cell, 2011, 21 (1) :77 - 91. Votteler J,ffi.S. Virus budding and the ESCRT pathway. [J]. Cell Host&Microbe，2013, 14(3) :232-241.)。
[0007] 肝细胞生长因子调节的酪氨酸激酶底物（hepatocyte growthfactor-regulated tyrosine kinasesubstrate，HRS)作为ESCRT-Ο的一个重要分子，可识别和募集范素 化修饰的底物，使底物进入多囊泡体介导的分选和降解途径（Henne丽，Buchkovich NJ，Emr SD. The ESCRT pathway. [J]· Developmental Cell，2011，21 (1):77-91. Votteler J,ffi.S. Virus budding and the ESCRT pathway. [J].Cell Host&Micro be，2013, 14(3) :232-241.)。
[0008] 近年来研究发现VPS4A和HRS均能介导柯萨奇病毒A9、轮转病毒等多种病毒 的的细胞入侵，表明VPS4A和HRS在病毒感染入侵阶段也发挥着重要作用（Huttunen M, Waris M，Kajander R，et al. Coxsackievirus A9infects cells via nonacidic multivesicular bodies. [J].Journal of Virology, 2014, 88 (9) :5138-5151. Silva-Ayala D,Lopez T，Gutierrez M，et al. Genome-wide RNAi screen reveals a role for the ESCRT complex in rotavirus cell entry. [J]. Proc Natl Acad Sci U S A，2013, 110 (25) : 10270-10275.)。
[0009] 目前还没有任何关于VPS4A和HRS分子在EV71感染宿主细胞（特别是Caco-2细 胞）中作用的报道，对于这两个分子进行深入研究不仅能够提升对EV71感染与致病机制的 认识，也可以为预防与治疗EV71感染提供新的思路与靶点。
【发明内容】
[0010] 本发明的目的在于提供一种抗肠道病毒71型感染的新靶点。
[0011] 本发明的另一目的在于提供液泡分选蛋白4A(vacuolar protein sorting 4hom〇log A，VPS4A)的新用途，特别是在抗肠道病毒71型感染中的应用。
[0012] 本发明的第三目的在于提供干扰VPS4A分子表达的siRNA。
[0013] 本发明的主要技术方案是：
[0014] 本发明以人结肠癌细胞（Caco-2)作为靶细胞，采用RNA干扰技术下调靶细胞宿 主蛋白的表达，来寻找可有效抑制EV71感染人结肠癌细胞（Caco-2)的宿主因子，从而达 到在肠道系统阻断病毒感染人体的目的。本实验选择了一组宿主细胞跨膜转运分子来进 行筛选，这些分子在宿主细胞的跨膜物质运输，囊泡的内吞与分泌中发挥着重要作用，它 们往往也是在病毒感染过程中易被病毒"劫持"并利用的分子。这些分子包括:ADP核糖 基化因子 6(ARF6)、caveolin-l(CAVl)、caveolin_2(CAV2)、caveolin_3(CAV3)、网格蛋白 轻链A(CLTA)、网格蛋白轻链B(CLTB)、网格蛋白重链（CLTC)、Flotillin蛋白1(FL0T1)、 Flotillin 蛋白 2(FL0T2)、GTP 酶激活蛋白（GRAF1)、白细胞介素 2 受体（IL2RB)、VPS4A、 HRS、Rab5a、Rab5b、Rab5c。通过检索NCBI GeneBank得到全序列和mRNA序列，利用现有的 网络资源及常用软件对这些基因进行生物学分析，选择编码区作为siRNA设计的靶序列， 然后设计siRNA，通过下调这些分子，来观察对EV71感染的影响。
[0015] 本发明发现液泡分选蛋白 4A(vacuolar protein sorting 4homolog A，VPS4A)在 EV71感染