miR-18a-5p抑制剂在制备防治骨质疏松药物中的应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物医学领域，具体涉及一种miR-18a-5p抑制剂在制备防治骨质疏 松药物中的应用。
【背景技术】
[0002] 骨质疏松症（osteoporosis, 0P)是由多种原因引起的，以单位体积内骨组织量减 少、骨密度降低为标志的全身性、进行性、代谢性骨病。0P分为原发性和继发性两种，原发性 0P又分为I型绝经后0P和II型老年性0P。在所有的0P患者中，均出现单位体积内骨组 织量（BV/TV)降低，骨矿密度（BMD)降低，骨微结构破坏的现象。在老龄化不断加剧的中国 社会，0P已经成为威胁老年人健康，降低生活质量的重要因素。
[0003] 破骨细胞（Osteoclast, 0C)由造血干细胞系髓系单核细胞分化而来，是人体骨 骼系统中唯一具有吸收和重塑骨骼形态功能的生理性多核巨细胞。在0C的分化过程中， RANKL和M-CSF是最重要的两种细胞因子。在骨吸收过程中，0C能够酸化其细胞外的微环 境至pH3. 0-4. 0。0C的活性和数量与人体正常生理稳态电解质平衡中的钙磷平衡及诸多内 分泌疾病包括骨质疏松症密切相关。研究发现，0P患者中破骨细胞活性明显提高，噬骨活 动增加，破骨细胞与成骨细胞耦连作用下降，最终导致骨吸收大于骨形成，骨生理稳态遭到 破坏，骨密度下降。
[0004] 微小RNA (microRNA，简称miRNA)是生物体内源长度约为15-22个核苷酸的非编码 小RNA，通过与靶mRNA的互补配对而在转录后水平上对基因的表达进行负调控，导致mRNA 的降解或翻译抑制。目前只有一小部分miRNAs生物学功能得到阐明，这些miRNAs具有调 节细胞生长，组织分化的功能，与生命过程中发育、疾病有关。近些年来越来越多的研究表 明，miRNAs在骨骼的生长发育及骨稳态调控中发挥重要功能，部分miRNAs甚至可以作为骨 相关疾病的生物学标志。
[0005] 目前，关于miR-18a的研究主要集中在胃癌标志物，细胞的增殖与癌细胞的转移 等方面，其在骨骼系统中的作用鲜有研究，尚未见关于miR-18a-5p抑制剂在制备防治骨质 疏松方面的任何报道。
【发明内容】
[0006] 有鉴于此，本发明的目的在于提供一种miR-18a_5p抑制剂在制备防治骨质疏松 药物中的应用。
[0007] 本发明采取的技术方案如下：
[0008] l、miR-18a_5p抑制剂在制备防治骨质疏松药物中的应用。
[0009] 优选的，miR-18a_5p抑制剂通过下调miR-18a_5p的表达，解除miR-18a_5p对 LXR-β基因表达的抑制，进而实现防治骨质疏松的目的。
[0010] 优选的，所述miR-18a-5p抑制剂包含如SEQ ID N0. 2所示的核苷酸序列片段。
[0011] 优选的，所述miR-18a-5p抑制剂为包含如SEQ ID N0. 2所示核苷酸序列的质粒或 转化体。
[0012] 优选的，所述转化体为腺病毒、慢病毒或噬菌体。
[0013] 2、miR-18a_5p抑制剂在抑制破骨细胞分化中的应用。
[0014] 优选的，所述miR-18a_5p抑制剂通过下调miR-18a_5p的表达，解除miR-18a_5p 对LXR- β基因表达的抑制，进而抑制破骨细胞分化。
[0015] 优选的，所述miR-18a-5p抑制剂包含如SEQ ID Ν0. 2所示的核苷酸序列片段。
[0016] 优选的，所述miR-18a-5p抑制剂为包含如SEQ ID N0. 2所示核苷酸序列的质粒或 转化体。
[0017] 优选的，所述转化体为腺病毒、慢病毒或噬菌体。
[0018] 本发明采用小鼠单核巨噬细胞系RAW264. 7细胞，在RANKL以及MCSF的刺激诱导 下向破骨细胞分化，通过microarray检测miRNAs的表达情况，发现miR-18a_5p在破骨细 胞分化中表达明显上调。为进一步验证，将原代小鼠骨髓单核细胞分离并通过RANKL以及 MCSF的刺激诱导向破骨细胞分化，使用荧光实时定量PCR技术检测原代小鼠骨髓单核细胞 向破骨细胞分化过程中miR-18a-5p的表达情况。结果提示诱导分化24h后miR-18a-5p表 达显著上调。进一步研究发现在小鼠原代单核细胞破骨分化过程中施加 pre-miR-18a-5p， 人为上调miR-18a-5p的表达后，破骨细胞分化效果显著提升。提示miR-18a-5p能够促进 破骨细胞分化成熟。
[0019] 在此基础上，本发明将miR-18a_5p抑制剂转染入小鼠原代骨髓单核细胞后通 过RANKL以及MCSF诱导破骨分化，通过TRAP染色以及检测破骨细胞分化的指标判断 miR-18a-5p对细胞破骨分化的影响。研究发现，转染miR-18a-5p抑制剂实验组TRAP强 度明显下降，同时标志破骨分化的Calcitonin Receptor等标志物表达均下调，融合分子 DC-STAMP、ATP6v0d2等也有明显下调。
[0020] 为了探讨miR-18a-5p抑制成骨细胞分化的可能分子机制，本发明通过 Targetscan对miR-18a-5p的潜在革E1基因进行了预测，并从预测结果中筛选出了可能与 miR-18a-5p抑制破骨细胞分化功能相关的候选靶基因一一LXR-beta。之后本发明设计了 相应的实验来验证LXR-beta是否是miR-18a-5p的靶基因。转染miR-18a-5p模拟物后发 现LXR-beta在mRNA水平变化不大，而在蛋白水平发生了显著降低，而转染miR-18a-5p抑 制剂后，LXR-beta的表达水平有所升高，说明miR-18a_5p通过直接靶向并下调LXR-beta促 进破骨细胞分化，而其抑制剂可以抑制破骨细胞分化、抑制骨钙丢失。
[0021] 本发明的有益效果在于：本发明采用小鼠单核巨噬细胞系RAW264. 7细胞， 在RANKL以及MCSF的刺激诱导下向破骨细胞分化，通过检测miRNAs的表达情况发现 miR-18a-5p在破骨细胞分化中表达明显上调；将miR-18a-5p抑制剂转染入小鼠原代骨髓 单核细胞后通过RANKL以及MCSF诱导破骨分化，并通过TRAP染色以及检测破骨细胞分化 的指标判断miR-18a-5p对细胞破骨分化的影响，结果发现，转染miR-18a-5p抑制剂实验组 TRAP强度明显下降，同时标志破骨分化的Calcitonin Receptor等标志物表达均下调，融 合分子DC-STAMP、ATP6v0d2等也有明显下调，这表明miR-18a-5p抑制剂可以抑制破骨细胞 分化、抑制骨钙丢失，进而一定程度起到防治骨质疏松的作用。因此，本发明为防治骨质疏 松提供了新的研究方向。
【附图说明】
[0022] 为了使本发明的目的、技术方案和有益效果更加清楚，本发明提供如下附图：
[0023] 图1 microarray芯片检测RAW264. 7细胞破骨分化过程中miRNAs表达情况，R(+) 表示经过RANKL和M-CSF诱导，R(-)为对照组。
[0024] 图2荧光实时定量PCR检测小鼠原代骨髓单核细胞破骨分化过程中miR-18a_5p 的表达结果，其中，RANKL (+)表示经过RANKL和M-CSF诱导，RANKL (-)为对照组。
[0025] 图3转染miR-18a-5p模拟物和miR-18a-5p抑制剂对于RAW264. 7细胞破骨分化 的影响，其中，RANKL(+)表示经过RANKL和M-CSF诱导，RANKL(-)为对照组，pre-miR-18a 表示转染miR_18a_5p模拟物组，anti-miR_18a表示转染miR-18a_5p抑制剂组。
[0026] 图4转染miR-18a_5p抑制剂抑制破骨细胞分化相关基因表达的荧光实时定量PCR 检测结果。图A-F依次为基因 c-FOS、Ctsk、DC-STAMP、NFATcl、TRAP和NFKB的表达结果。 pre组表示miR-18a_5p模拟物组、anti组表示miR-18a_5p抑制剂组，preNC组和antiNC 组分别为其各自的对照组（对照是无影响的碱基片段）。
[0027] 图5双荧光报告系统检测LXR-beta是miR-18a_5p靶基因结果图，pre-miR_18a表 示转染miR-18a-5p模拟物组，anti-miR-18a表示转染miR-18a-5p抑制剂组，NC组为对照 组。其中，A图为对miR-18a与Nrlh2(LXR-f3)的3' -UTR结合进行预测，B图为双荧光报 告系统检测结果对预测结果的证实。
[0028] 图6 Westen blot验证LXR-beta是miR-18a_5p革巴基因，pre组表不转染 miR-18a_5p模拟物组，anti组表示转染miR-18a_5p抑制剂组，preNC组和antiNC组为对 照组。
【具体实施方式】
[0029] 下面结合附图和实施例对本发明做详细说明，所述是对本发明的解释而不是限 定。
[0030] 小鼠原代骨髓单核细胞（Bone Marrow Monocytes, BMMs)由小鼠长骨骨髓细胞分 离而来，在RANKL以及MCSF的刺激诱导下可以向破骨细胞分化，是研究破骨细胞分化，融 合，成熟，噬骨等生物学行为的常用原代细胞模型。同时破骨细胞与成骨细胞、骨细胞、基质 细胞等都有密切的关联和耦合作用，是体内骨稳态、电解质稳态以及促进骨形成的重要调 控元素。骨质疏松往往由过多的骨吸收导致，是破骨细胞过度活化的结果。故选择小鼠骨 髓单核细胞作为细胞模型进行相关研究。
[0031] 本文所述miR-18a_5p模拟物为miR-18a_5p的替代品，其作用类似于miR-18a_5p。
[0032] 1、破骨细胞分化过程中miRNA表达情况检测
[0033] 首先体外诱导小鼠原代骨髓单核细胞破骨分化，操作步骤如下：
[0034] 将小鼠原代骨髓单核细胞RAW264. 7细胞以1 X 103个/孔接种于96孔板，待细胞 长满后弃掉培养基，同时分别以终浓度50ng/mL的RANKL和M-CSF诱导小鼠原代骨髓单核 细胞向破骨细胞分化，以普通培养基（DMEM高糖培养液+10%胎牛血清+1 %双抗）作为对 照。诱导72h后即可见多核（核数量大于3)的破骨细胞形成。培养基成分优选为DMEM高 糖培养液+10 %胎牛血清+1 %双抗（青链霉素）。
[0035] 将上述获得的破骨细胞进行总RNA提取，步骤如下：
[0036] 收获破骨细胞时，加入1ml TRIZ0L裂解细胞并用吸管反复吹吸5min，然后将细胞 转至1. 5ml离心管中，并加入0. 2ml氯仿，漩祸振荡器上用力震摇15s，然后室温放置3min， 4°C、12, OOOXg离心15min，再将占总体积约60%的无色上层水相转移至新的1. 5ml管中， 加入0· 5ml异丙醇，混勾，室温作用10min，4°C、12, OOOXg离心10min，弃去上清，加入lml 体积分数75%的乙醇（DEPC水配置）洗涤沉淀，震荡，4°C、7,500Xg离心5min，弃上清，将 沉淀于37°C干燥5~lOmin，加入30 μ 1 DEPC水重新溶解，贮存于-70°C或直接使用。
[0037] RNA提取完毕后用microarray芯片检测破骨细胞分化过程中miRNA表达情况，检 测由博奥生物（上海）完成，运用Sanger miRBase数据库，共检测小鼠的1191种miRNA， 其中，P值小于〇. 05,且变化倍数多2的miRNA被认为是显著变化的miRNA，这其中便包括 miR-18a-5p，其在破骨细胞分化的72h和192h与对照组相比均显著上调（图1)。
[0038] 根据所得microarray芯片结果，使用Ambion公司的小RNA试剂盒（Taqman MicroRNA Assay)，根据试剂盒操作手册的标准操作流程，使用荧光实时定量PCR技术 检测小鼠原代单核细胞向破骨细胞分化不同时