融合混合物的制作方法
【专利说明】融合混合物
[0001]本发明涉及用于在体内或者在体外修饰任意脂膜、细胞膜、细胞膜组成部分或者与细胞其余组成部分分离的细胞膜的含脂质的膜的融合混合物，以及涉及通过与该混合物融合修饰含脂质的膜的方法。
【背景技术】
[0002]对于治疗用途而言，存在着对将药学活性物质引入到目标细胞中的方法的需求。
[0003]由 Khalil 等人(1.A.Khalil,K.Kogure,H.Akita,H.Harashima, 2006.UptakePathways and Subsequent Intracellular Trafficking in Nonviral Gene Delivery.PHARMACOLOGICAL REVIEWS，第58卷，第1期，32-45)已知，对于DNS可区分为胞吞和非胞吞吸收方法。在科学界中根据该评论文章认为，DNS的主要吸收方式借助脂质复合体(Lipoplexen)(也称为阳离子脂质-DNA复合体)以胞吞方式进行。细胞外大分子的囊泡吸收称为胞吞。据此，直至1990年代中期认为的在脂质复合体的脂质与细胞膜融合之后的大分子的直接吸收不能再站得住脚，而最多以极小比例参与。
[0004]Friend等人的论文为该假设提供了证据，其中通过电子显微照片展示了胞吞之后囊泡中的 DNS (Friend DS，Papahadjopoulos D 和 Debs RJ (1996) Endocytosisand intracellular processing accompanying transfect1n mediated by cat1nicliposomes.B1chim B1phys Acta 1278:41 - 50)。该吸收方式由 Wei jun和 Szoka Jr.证明(Weijun Li和Francis C.Szoka Jr.2007.Lipid-based Nanoparticles for NucleicAcid Delivery.Pharmaceutical Research，24，438-449)。
[0005]阳离子脂质可以用于制备阳离子脂质体。已知由这些起始成分形成阳离子脂质体难于控制，因为由这些起始物质可能形成不同的结构。因此，将阳离子脂质与作为所谓的辅助物脂质的中性脂质预先均匀地混合以形成脂质体，因为仅阳离子脂质明显不能够确保形成脂质体。如由上述Khalil等人的文献已知(Khalil等人，第40页，右栏，第一段)，例如使用DOPE或者胆留醇作为辅助物。
[0006]该辅助物脂质例如具有亲水性区域以及有或没有双键的疏水性区域(尤其C10-C30)o两种区域均具有中性性质。由此，中和了分子种类A的带正电的分子之间的大的电荷密度和排斥力。该作用导致该体系的稳定。因此，使用辅助物脂质是必需的，并且此外提高了该体系的转染效果。所述辅助物脂质的比例设定为直至最大70%重量/重量。合适的分子例如是磷脂酰乙醇胺、磷脂酰胆碱(1，2- 二油酰基-sn-甘油基-3-磷酰乙醇胺、1，2- 二棕榈酰基-sn-甘油基-3-磷酰乙醇胺、1，2- 二肉豆蔻酰基-sn_甘油基-3-磷酰乙醇胺、1，2-二-十八稀酰基(Dielaidoyl)-sn-甘油基_3_磷酰乙醇胺、1，2-植烧醇甘油基-3-磷酰乙醇胺、1，2-二亚油酰基-sn-甘油基-3-磷酰乙醇胺或者1，2_ 二油酰基_sn_甘油基-3-磷脂酰胆喊)。
[0007]具有中性辅助物脂质的带正电的融合混合物例如从W0 2011/003406 A2中已知。所公开的融合混合物在每种情况中基于由分子种类A (阳离子脂质)、分子种类B (荧光标记物)和分子种类C，即中性辅助物脂质构成的一种具体组成。在此，脂质体与在附着在细胞上的细胞膜及其质膜融合，其中建议分子种类A:B:C的比例为1:0.1:1重量/重量。
[0008]由 Csiszcir 等人(Csiszcir A.等人Novel Fusogenic Liposomes for FluorescentCell Labeling and Membrane Modificat1n, B1conjugate Chemistry，2010，21，537-543)已知融合的脂质体体系，其由阳离子的(分子种类A)、中性的(分子种类C)和芳族脂质(分子种类B)构成，并且其中分子种类A:B:C以1:0.1:1重量/重量的比例存在。使用D0TAP作为分子种类A，荧光亲脂性分子如Di0、DiR、氟硼二吡咯-、丽丝胺_罗丹明_和FITC-标记的脂质作为分子种类B。使用DOPE作为辅助物脂质C。该混合物用于构建脂质体，并且此外用于荧光细胞标记、蛋白质嵌入、细胞膜功能化、活性物质吸收、DNA-吸收等。作者特别地表示，仅这3种组分的协同相互作用产生有效融合的混合物。
[0009]Kleusch 等人(Kleusch Ch.等人 Fluorescent lipids: funct1nal parts offusogenic liposomes and tools for cell membrane labeling and visualizat1n,1016(311168，2011，16，221-250)同样公开了分子种类厶:8:〇以1/0.1/1重量/重量比例的阳离子脂质体体系，其中两种焚光分子(分子种类B)具有两种连续的(aufeinanderfolgend)功能。首先，一种生物上不重要的荧光组分促进细胞质膜和融合脂质体的脂质双层之间的快速的细胞融合，该融合脂质体包含中性(细胞种类C)和带正电的(细胞种类A)脂质。在嵌入到细胞膜中之后，可以通过确定第二种荧光组分的量来进行细胞膜和/或在该处进行的传输过程的荧光展示。该融合脂质体体系因此具有四种组分(细胞种类A、细胞种类C和两种细胞种类B)，并且类似于Csiszcir等人或者在W0 2011/003406中的3元体系，仅以精确给定和固定的相互比例来公开。
[0010]因此，由现有技术已知的融合混合物的缺点是分子种类A、B和C狭窄的浓度范围以及为了获得有效融合的混合物，至少3种组分的协同相互作用。
[0011]发明目的
本发明的目的是，由少量分子种类提供易于组成的融合混合物，其用于在体内或者在体外修饰任意脂膜、细胞膜、细胞膜的组成部分或者与细胞其余组成部分分离的细胞膜的含脂质的膜。该融合混合物应与任意脂膜融合。该融合混合物的组成部分尤其应可以在相对大的浓度范围中彼此存在，以能够根据细胞膜的类型和所用的融合混合物的成分来快速和有效地实施融合。
[0012]进一步地，该融合混合物应能容易地制备。
[0013]此外，本发明的目的是提供用于与该融合混合物有效地进行膜融合的方法。
_4] 达成目的的方法
用根据专利权利要求1的融合混合物和根据专利权利要求6的方法实现所述目的。对此有利的实施方案由各自的从属专利权利要求获悉。
_5]发明描述
用于在体内或者在体外修饰任意脂膜例如细胞膜、细胞膜的组成部分或者与细胞其余组成部分分离的细胞膜的含脂质的膜的融合混合物包含带正电的两亲性分子A和为芳族分子的分子B。在此，分子种类A和B以1:0.02至1:2摩尔/摩尔的比例存在。
[0016]与现有技术和迄今的学术观点相反，令人惊奇地已认识到，中性辅助物脂质形式的分子种类C对于可重复和有效地获得融合混合物与任意脂膜的融合而言不是必需的。
[0017]分子种类A和分子种类B在本发明的融合混合物中以1:0.02至1:2摩尔/摩尔的A:B比例存在。优选地存在1:0.05至1:1摩尔/摩尔的A:B比例。该混合摩尔比相比于已知的混合比而言是令人惊奇得宽的。
[0018]有利地，根据本发明的融合混合物可以存在于水性悬浮体中。
[0019]在本发明的范围内看出并且借助实验证据表明，可以以给出的A:B比例范围在不存在其它脂质组分的情况下实施可重复的膜融合。
[0020]令人惊奇地已认识到，融合的充足条件是所给出的比例的两亲性分子A和芳族化合物B。
[0021]在本发明的融合混合物的情况中有利的是，其可以比根据现有技术的混合物更容易制备，因为根据现有技术的混合物包含至少三种分子种类。
[0022]借助在给出的范围中选择两种分子种类A和B特别有利地导致能够实施可重复的膜融合，更确切地说无论何种物质均可借助该融合混合物引入到细胞上或者细胞中。在此，在该融合混合物与任意脂膜或其组成部分或其片段接触之后快速地，即在几分钟内进行融合。该融合可以在体内或者在体外实施。
[0023]根据本发明的融合混合物可以补充至少一种添加剂Z，例如:
1.合成的脂质分子和脂质混合物，
2.天然的脂质分子或脂质混合物，
3.细胞质蛋白质和跨U旲蛋白质，
4.蛋白质-脂质-混合物，
5.不同的核酸(例如DNA、siRNA)，
6.各种纳米颗粒(磁性的、荧光的等)，
7.用药学活性物质或者其它的化学或者生物物质。
[0024]在此应注意，附加的组分Z的比例通常不应超过所述融合混合物的46摩尔％。根据添加剂Z的种类和所基于的具有A和B的融合混合物，Z当然能够具有1至46摩尔％的所有可能的中间值。根据应用目的，还可以在根据本发明的融合混合物中存在多种不同的添加剂。
[0025]如果将多种添加剂ΖΡ..Ζη添加到融合混合物中，则这些Zl...Ζη通常也具有最大46摩尔％的总比例。
[0026]本发明的融合混合物既可以在与合成模型膜(囊泡)融合时使用，也可以用于与细胞膜，包括质膜或者细胞细胞器膜及其组成部分或者片段融合。
[0027]这样融合的膜颗粒可以有利地还具有融合性能，从而使其能够用于与其它膜进一步融合。可以如各自的(中间_)产物的融合性能已知的那样经常地重复这样的融合。
[0028]可以在悬浮体中或者在贴壁膜的表面上实施所述融合。
[0029]根据本发明的带正电的融合混合物以1:0.02至1:2摩尔/摩尔的A:Β比例含有分子种类Α和B。分子种类B在此可以取对分子种类A的各个中间值，即以1:0.02、1:0.03、1:0.04