自溶性微针透皮贴片及其制备方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于经皮给药技术领域中的自溶性微针，特别涉及自溶性微针透皮贴片及 其制备方法。
【背景技术】
[0002] 目前大多数的疫苗都是采用皮下或肌肉注射的方式进行接种，存在疼痛、需专业 人员操作、疫苗的药代动力学曲线不理想、注射针的重复使用会引发传染病的传播等问题。 因此顺应性好、方便、高效、安全的新型疫苗递送系统的研究一直是疫苗领域的热点。经皮 免疫（Transcutaneousimmunization，TCI)是指局部应用疫苗抗原和（或）佐剂于皮肤 表面以引起免疫反应。皮肤是疫苗免疫的一个理想部位，其中含有比肌肉、皮下组织中更 丰富的抗原呈递细胞（Antigenpresentingcells,APCs)。表皮中富含的朗格罕斯细胞 (Langerhanscells,LCs)及真皮中富含的树突状细胞（dermaldendriticcells.dDCs)， 形成独特强有力的免疫识别、应答和效应网络。但是，传统的透皮技术仅适用于脂溶性小分 子药物，生物大分子药物的经皮给药难以实现。因此经皮免疫的关键之处在于如何将足够 量的疫苗抗原和佐剂透过角质层传递至皮肤中的免疫细胞。
[0003] 基于BioMEMS技术开发的微针阵列经皮给药技术是药物释放领域的重大技 术突破，它结合了注射和经皮给药两大优势，为经皮免疫提供了新的可能性。微针 (Microneedles)长度小于1_，其穿刺皮肤可产生微米级药物运送通道，允许大分子通过。 控制微针的高度可使其穿刺深度不接触到神经末梢，无痛无血就可使生物大分子实现皮内 释放。自溶性微针（self-dissolvingmicroneedles)是近几年来出现的一种新型微针。其 采用可溶于水的聚乙烯吡咯烷酮（PVP)、羧甲基纤维素钠（CMC-Na)等高分子材料作为微针 的基质，药物分散在基质中，微针刺入皮肤后可溶解于皮肤组织液中，从而被机体吸收。与 早期的硅或金属微针相比，自溶性微针应用于皮肤后能够溶解于其中，无需后续的处置和 回收过程，而且降低了材料和工艺的成本。另外，由于采用医用材料，使最终获得药监部门 批准的可能性大大增加。因此，自溶性微针已成为当今微针技术的发展趋势。
[0004] 目前，研究表明微针介导的疫苗经皮免疫倾向于诱导更强的辅助性T细胞2(Th2) 型体液免疫应答，对许多疾病而言，辅助性T细胞l(Thl)型的细胞免疫应答也是必须的 (J.Control.Release，2010,147 :326 - 332;PlosOne, 2009, 4:47-73)。因此需要选择合适 的佐剂来提高经皮免疫所诱导的细胞免疫反应应答，实现体液免疫反应和细胞免疫反应的 平衡。目前自溶性微针普遍采用聚乙烯吡咯烷酮（PVP)、羧甲基纤维素钠（CMC-Na)、聚乙烯 醇（PVA)等作为基质，其本身不具备佐剂的作用，佐剂的添加来自其他外源性材料。额外添 加的佐剂会带来成本增加以及微针的成型性和机械强度变差的问题。此外，目前常用的佐 剂包括铝佐剂、脂质体、弗氏佐剂、粘膜免疫佐剂、CpG序列、细胞因子以及纳米粒子佐剂，但 是上市的人用疫苗佐剂经美国FDA批准的只有铝佐剂。铝佐剂主要诱导体液免疫应答，而 细胞免疫很弱，无法解决经皮免疫中细胞免疫弱的问题。新型疫苗递送系统的研究开发致 力于解决上述问题，达到有效、安全、稳定、经济的目的。
[0005] 危险信号模式理论为我们提供了全新的视野。PollyMatzinger于1994年提出危 险信号模式理论，在该模式中，免疫系统的功能是参与识别危险信号分子与非危险信号分 子。细胞损伤释放的危险信号分子可以激活APC进而有效的激活T/B细胞产生相应的免疫 应答。内源性危险信号具有交叉递呈抗原，诱导细胞免疫的特性，提示内源性危险信号可作 为疫苗佐剂诱导特异性的细胞免疫应答。
[0006]KAScheibner等发现高分子量透明质酸的降解片段即低分子量透明质酸是一个 内源性危险信号（theJournalofImmunology, 2006, 177:1272-1281)。当机体组织受损， 商分子量透明质酸（分子量200万~600万）在氧自由基以及酶的作用下解聚为低分子量 透明质酸（分子量20万）。低分子量透明质酸与TLR-2作用后，以依赖于MyD88/IL-lR相 关激酶、TNFR相关因子-6、蛋白激酶Cζ、NF-κB的方式进行信号传导，激活机体的天然免 疫应答；高分子量透明质酸则抑制TLR-2的信号传导。透明质酸是细胞外基质的重要成分， 它是构成皮肤、玻璃体关节滑液和软骨组织的重要成分，具有独特的理化性质和生物学功 能。透明质酸中的重复二糖单元在所有物种和组织中都是一致的，因此不导致透明质酸分 子自身的免疫排斥。低分子量透明质酸（分子量〈100万）是透明质酸的降解产物，具有完 整的透明质酸结构，生物活性高，无毒副作用，目前主要在各类化妆品中用于保湿、抗衰老、 晒后修复等。研究结果表明，寡聚透明质酸（分子量〈10, 〇〇〇)能够明显增强灭活HAV抗原 的免疫应答，具有强的免疫佐剂作用，其免疫佐剂效应优于铝佐剂（细胞与分子免疫学杂 志，2008, 24:183-185)。
[0007]GeoffreyBJ等发现（theJournalofImmunology, 2002, 168:5233-5239)，可溶 性硫酸肝素利用TLR4激活树突状细胞。硫酸肝素是一种酸性多糖，位于细胞膜和细胞外 基质。硫酸肝素的降解产物，即低分子量硫酸肝素，能够活化树突状细胞。目前，低分子量 硫酸乙酰肝素被认为是一种新型抗血栓和抗肿瘤转移药物，具有很强的抗血栓和抗肿瘤活 性，调节免疫功能和调血脂、抗动脉粥样硬化等作用，无明显毒副作用。研究结果表明，低分 子量硫酸乙酰肝素与乙肝表面抗原混合后，经鼻腔、肌肉及皮下注射3种途径免疫小鼠，既 能有效增强特异性体液免疫应答，又能显著诱导CTL细胞免疫效应，是一种优于铝佐剂的 潜在人用疫苗佐剂（中国生物制品学杂志，2011，24 :5-9)。
【发明内容】
[0008] 本发明的目的之一是克服现有的注射接种疫苗的缺点，提供一种适合于经皮免疫 的自溶性微针疫苗透皮贴片，从而实现顺应性好、方便、高效、安全的疫苗递送。
[0009] 本发明的目的之二是提供一种自溶性微针疫苗透皮贴片的制备方法。
[0010] 本发明是将内源性的寡聚透明质酸和/或低分子量的硫酸乙酰肝素同时作为自 溶性微针透皮贴片中的微针基质材料和疫苗佐剂，不用添加外源性佐剂来增强抗原的免疫 原性，解决了现有经皮免疫技术难以诱导Thl型细胞免疫的问题。
[0011] 本发明的自溶性微针透皮贴片是由微针基质材料、疫苗、疫苗佐剂和疫苗保护剂 构成，其中，所述的微针基质材料和疫苗佐剂均为寡聚透明质酸、低分子量的硫酸乙酰肝素 或其组合。
[0012] 根据本发明的一种实施方式，其中，疫苗在所述的自溶性微针透皮贴片中所占的 百分含量为总重量的0.001%~10%，疫苗保护剂在所述的自溶性微针透皮贴片中所占的 百分含量为总重量的0. 01 %~30%，微针基质材料和疫苗佐剂在所述的自溶性微针透皮 贴片中所占的百分含量为总重量的60%~99. 98%。优选地，疫苗在所述的自溶性微针透 皮贴片中所占的百分含量为总重量的〇. 01 %~1 %，疫苗保护剂在所述的自溶性微针透皮 贴片中所占的百分含量为总重量的〇. 1%~20%，微针基质材料和疫苗佐剂在所述的自溶 性微针透皮贴片中所占的百分含量为总重量的80%~99. 8%。
[0013] 所述的疫苗保护剂选自甘露醇、肌醇、山梨醇、聚乙二醇、蔗糖、乳糖、海藻糖、聚 糖、糊精、人血清白蛋白、明胶、精氨酸、脯氨酸、色氨酸、谷氨酸、谷氨酸钠、丙氨酸、甘氨酸、 赖氨酸盐酸盐、肌氨酸、L-络氨酸、苯丙氨酸中的至少一种。优选地，所述的疫苗保护剂选 自甘露醇、肌醇、山梨醇、聚乙二醇、蔗糖、乳糖、海藻糖、聚糖、糊精中的至少一种。进一步优 选地，所述的疫苗保护剂选自蔗糖、乳糖、海藻糖、聚糖、糊精中的至少一种。
[0014] 本发明的自溶性微针透皮贴片中的寡聚透明质酸和/或低分子量的硫酸乙酰肝 素同时作为微针基质材料和疫苗佐剂使用。与分子量较大的透明质酸和硫酸乙酰肝素相 t匕，分子量小于10, 〇〇〇的寡聚透明质酸和分子量小于10, 〇〇〇的低分子量的硫酸乙酰肝素 具有更好的佐剂作用，因此本发明中采用重均分子量在10, 〇〇〇以内的寡聚透明质酸和重 均分子量在10, 〇〇〇以内的低分子量的硫酸乙酰肝素。作为微针基质材料而言，寡聚透明质 酸和低分子量的硫酸乙酰肝素的重均分子量越小，制得的微针硬度越强；重均分子量越大， 微针的机械强度及韧性越强。因此寡聚透明质酸和低分子量的硫酸乙酰肝素的重均分子量 越小，用于刺入皮肤的微针越硬，越容易刺入皮肤，但是机械强度也随之降低，保存及刺入 皮肤时容易折断。由此，本发明优选使用的是寡聚透明质酸的重均分子量的范围是5000〈 重均分子量〈10, 〇〇〇,低分子量的硫酸乙酰肝素的重均分子量的范围是4000〈重均分子量 <10,000〇
[0015] 根据本发明的一种实施方式，所述的自溶性微针透皮贴片的规格为每平方厘米含 有16~484根微针，微针的高度在150~1000微米之间，针尖的直径在100纳米~20微 米之间，微针的最大截面的锥角是20~60度。优选地，所述的自溶性微针透皮贴片的规格 为每平方厘米含有36~256根微针，微针的高度为300~800微米，针尖的直径为500纳 米~10微米，微针的最大截面的锥角是30~50度