一种载microRNA的石墨烯-金纳米复合物及其制备方法和应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及医药技术领域，具体地涉及一种靶向诱导耐药卵巢癌细胞凋亡的纳米药物递送系统及其制备方法。该药物递送系统通过负载非化疗药物而降低毒副作用、避免多药耐药，并以靶向、控释、联合疗法的方式提高对耐药卵巢癌的治疗效果。
【背景技术】
[0002]癌症是一类严重危害人类生命健康和生活质量的常见病。其中卵巢癌的全球病死率在妇科肿瘤中列居首位，是女性健康的杀手之一。中国肿瘤登记年报最新数据也显示，我国卵巢癌目前发病率为4.54/10万，同期死亡率高达3.44/10万，严重威胁我国广大女性的生命安全与生活质量。
[0003]癌症的治疗方法主要包括化学治疗、手术治疗和放射治疗。与手术治疗和放射治疗相比，化学治疗是一种全身性治疗手段，对原发灶、转移灶和亚临床转移灶均有治疗作用，适于中、晚期肿瘤，转移性肿瘤和亚临床转移灶。目前卵巢癌临床治疗以肿瘤细胞减灭术辅以联合化疗方案为主，即便是晚期患者，首次治疗通常也能有效缓解，但患者五年存活率仍徘徊在20-30%，究其原因多药耐药是导致卵巢癌治疗失败的关键原因。多药耐药是指肿瘤细胞接触某种抗癌药产生耐药的同时，也会对其它结构和功能不同的药物产生交叉耐药，多药耐药基因(MDR1)及其所编码的细胞膜P糖蛋白(P-gp)表达增加、谷胱甘肽转移酶的活性增强、DNA拓扑异构酶II活性降低、多药耐药相关蛋白增加等是其重要特征。因此，寻求针对耐药卵巢癌细胞具有高效杀伤作用的治疗手段十分迫切。
[0004]抗癌药物在全身给药时存在着两个问题:第一，有些药物难于到达患部，为了提高药物在患部的浓度，就必须提高给药量，这样便会造成药物浪费和严重的毒副作用。第二，化学治疗药物毒性很强，在杀死癌细胞的同时，对正常细胞也有强烈的杀伤作用，有时还可能破坏患者的免疫功能，使癌症患者往往由于其免疫功能遭受破坏，受病菌感染致死。所以有必要开发出具有肿瘤靶向功能的药物递送载体，负载非化疗药物，降低毒副作用、避免多药耐药，从而提高治疗效果。
[0005]靶向型药物输送是指运用特殊的药物输送载体或者给药技术，将药物有目的地浓集于特定的组织或器官的给药系统。靶向型药物输送载体最显著的特点是能使药物具有药理活性的专一性，并增加药物对靶组织的指向性和滞留性，减低药物对正常细胞的毒副作用，剂量少，提高药物制剂的生物利用度，提高药品的安全性、有效性、可靠性和顺从性。到目前为止，纳米材料是公认最有希望的靶向型药物输送载体，具有尺寸小、比表面积大、表面反应活性高、活性中心多、催化效率高、吸附能力强等特性，当其作为药物递送系统时，有望实现器官靶向、高效和低毒等革命性的突破。
[0006]目前，用于负载药物的纳米材料一般包括脂质体、金属纳米载体和高分子聚合物等，继而通过在这些纳米材料表面连接上革E向性分子(如肿瘤细胞表面的特异性抗体或特异性小分子)来实现抗肿瘤药物的靶向递送作用。尤其是智能纳米材料应用于肿瘤药物递送系统，将具有其独特功能，能够随局部环境的变化或刺激而产生反应，发生结构或功能的改变，使所载药物顺利在体内的特定病灶部位释放，从而实现靶向给药，提高药物的治疗效果Ο
[0007]石墨烯是近年发现的一种二维碳纳米材料。由于其独特的结构，使其在生物医学、复合材料、传感器、能源等领域具有重要的应用前景。由于石墨烯具有单原子层结构，其理论比表面积高达2600m2/g，非常适合做药物载体。同时其两个基面都可以吸附药物，所以具有其他纳米材料无可比拟的超高载药率。并由于其大η共轭结构，可以通过J1-Ji相互作用固定治疗肿瘤所需的疏水性药物分子，这就使其在药物传递系统方面具有良好的应用前景。
[0008]而已知的金纳米颗粒主要通过四种方式应用于癌症治疗:①金纳米颗粒自身的作用；②金纳米颗粒携带抗癌药物；③金纳米颗粒的光热疗作用；④金纳米颗粒携带抗癌药物和光热疗的联合作用。通过对其表面的修饰，金纳米颗粒容易吸附小分子、寡肽、核酸等材料，实现携带抗癌药物特异性靶向肿瘤细胞/肿瘤组织的功能；也可通过各种方式使所携带的抗癌药物在特定部位、特定条件下缓控释放，实现高效可控杀伤肿瘤细胞的功能。而金纳米颗粒作为抗癌药物或药物载体的独特优越性还在于，其颜色随粒径从小到大依次呈现出红色到紫色的不同变化，可吸收不同波长的光，产生热效应，进而局部升温杀伤肿瘤细胞，实现联合疗法。
[0009]在生物治疗领域，除了传统的核酸制剂、蛋白制剂，mi croRNA的作用日益受到关注。microRNA是一类长度为18-25个核苷酸的单链非编码RNA，广泛存在于真核生物中，主要通过与靶mRNA的3’端非翻译区(3’UTR)完全或部分互补配对结合，导致靶mRNA降解或翻译受到抑制，从而在转录后水平负调控靶基因的表达。microRNA广泛参与了生物体多种生理及病理过程，如个体发育、细胞增殖、凋亡和分化、代谢、免疫与应激反应的调节、肿瘤形成等。已有大量文献报道microRNA参与了多种与卵巢癌密切相关的生物学过程，如癌细胞增殖、分化、侵袭、凋亡等。其中，miR-193a在多种卵巢癌细胞中呈现低表达，以经典的抑制凋亡的BCL-2家族之MCL1基因为其直接作用靶标，激活caSpaSe3/7信号途径，发挥抑癌基因的作用，且其表达量的变化与卵巢癌细胞耐药相关。
[0010]然而，miR-193a不稳定，极易被广泛存在的核酸酶降解。开发miR_193a分子药物的主要障碍在于如何使miR-193a通过细胞膜，并且传递到细胞内发挥降解靶基因mRNA的作用。目前，病毒型miR-193a载体虽然传递效率高，但是生物安全性限制了它的应用。非病毒miR-193a载体，包括合成纳米颗粒聚合体和脂质体载体来进行运输等方法在一定程度上能改善miR-193a的效果。因此，如何选择合适的载体提高目标miR_193a携带进入相关组织细胞的效率，并且保护miR-193a不被降解，是实现miR_193a治疗的难题。因此，相较于传统的广谱型的抗癌化学药物，选择生物学药物miR-193a，来控制耐药卵巢癌细胞的生长和凋亡，不仅相对毒性较小，结合纳米药物递送载体后更具有高效、靶向、可控的优点，将有望开发出针对耐药卵巢癌的药物制剂。
【发明内容】
[0011]发明目的:本发明所要解决的第一个技术问题是提供了一种载microRNA的石墨烯-金纳米复合物。
[0012]本发明所要解决的第二个技术问题是提供了一种载microRNA的石墨稀-金纳米复合物的制备方法。
[0013]本发明所要解决的第三个技术问题是提供了一种载microRNA的石墨稀-金纳米复合物在制备靶向诱导耐药卵巢癌细胞凋亡的纳米药物递送系统方面的应用。
[0014]本发明所要解决的第四个技术问题是提供了一种靶向诱导耐药卵巢癌细胞凋亡的纳米药物递送系统。
[0015]技术方案:为了解决上述技术问题，本发明提供了一种载microRNA的石墨稀-金纳米复合物，该复合物由里而外由三部分有机组成:金纳米颗粒、microRNA和石墨稀。
[0016]进一步地，本发明所述的microRNA为miR_193a。
[0017]上述的一种载microRNA的石墨稀-金纳米复合物的制备方法，包括以下步骤:
[0018]1)载microRNA金纳米颗粒的制备:滴加新鲜配制的硼氢化钠、十六烷基三甲基溴化铵和氯金酸到20-100mL水中，在室温下保持20分钟磁力搅拌，得到粒径约3_10nm的金纳米颗粒，用microRNA和金纳米颗粒混合并搅拌30分钟，离心回收上述金纳米颗粒，上清液测0D值，定量microRNA的负载量；
[0019]2)载P-gP抗体的氧化石墨稀的制备:将石墨稀和氯化钠以质量比1:50 —起碾磨十分钟，将研磨物在水中溶解并过滤，将过滤物用H2S04氧化并搅拌8小时得到混合物1，将lg/mL ΚΜη04溶液逐滴加入到上述混合物1中，期间保持反