对baff和b7rp1具有特异性的蛋白和其用图
【专利说明】对BAFF和B7RP1具有特异性的蛋白和其用途
[0001] 相关申请的交叉引用
[0002] 本申请要求2013年3月13日提交的美国临时申请号61/780, 260和2014年2月 21日提交的美国临时申请号61/942, 776的权益，所述临时申请各自全文并入本文中。
[0003] 领域
[0004] 本文所述的双特异性分子在蛋白治疗剂的领域内。
[0005] 背景
[0006] 大多数治疗蛋白以高特异性结合于单一靶标蛋白，由此干扰这种单一靶标蛋白的 活性。这种蛋白可为介导所治疗的人类疾病的一种或多种生物途径的一部分，并且所述治 疗蛋白可因此抑制疾病进展。然而，治疗蛋白的效力很少对所有患者均完全。治疗蛋白的 不完全效力可能在一些情况下归因于疾病的复杂性。例如，一些疾病可通过多种生物途径 介导，或不同生物途径可在具有相同的临床上确定的病况的不同患者中在介导疾病活动性 方面发挥主要作用。因此，在一些疾病中可能有利的是同时抑制至少两种生物途径。
[0007] 概述
[0008] 本文提供可结合于人类B7相关蛋白1 (B7RP1，还称作GL50和T细胞共刺激配体 (IC0SLG))和人类B细胞激活因子（BAFF，还称作肿瘤坏死因子超家族成员13b(TNFSF13B)) 并且抑制其生物活性的双特异性蛋白。BAFF在B细胞生存中发挥作用，并且B7RP1在T细 胞共刺激中发挥作用。因此，抑制这两种蛋白的活性的蛋白干扰B和T细胞的活性。
[0009] 本文描述双特异性蛋白，其中所述蛋白可抑制人类B细胞的BAFF介导的增殖并且 其中所述蛋白可抑制人类T细胞的B7RP1介导的增殖。所述双特异性蛋白可包含IgG抗 体，所述抗体包含具有不同氨基酸序列的两条免疫球蛋白重链和具有不同氨基酸序列的两 条免疫球蛋白轻链。所述IgG抗体可抑制人类B细胞的BAFF介导的增殖和人类T细胞的 B7RP1介导的增殖。所述IgG抗体可为IgGl、IgG2、IgG3或IgG4抗体并且可为人类或人源 化IgG抗体。所述双特异性蛋白可包含包含氨基酸序列SEQIDN0 :8的轻链互补决定区 1 (⑶R1)、包含氨基酸序列SEQIDN0 :9的轻链互补决定区2(⑶R2)、包含氨基酸序列SEQ IDN0 :10的轻链互补决定区3(CDR3)、包含氨基酸序列SEQIDN0 :11的重链⑶R1、包含氨 基酸序列SEQIDN0 :12的重链⑶R2以及包含氨基酸序列SEQIDN0 :13的重链⑶R3。此 外，所述双特异性蛋白可包含包含SEQIDN0:15的重链可变区或其变体和包含SEQIDN0: 14的轻链可变区或其变体。所述变体序列相对于参考序列可包含每100个氨基酸不超过 10个单一氨基酸的缺失、插入或取代。
[0010] 在一个替代实施方案中，可抑制人类B细胞的BAFF介导的增殖并且可抑制人类T 细胞的B7RP1介导的增殖的双特异性蛋白可包含：(a)包含具有下式的氨基酸序列的多肽： A-L1-P-L2-P，其中A为IgG抗体的免疫球蛋白重链，L1为第一连接体，所述第一连接体不存 在或为3至40个氨基酸长，P为10至40个氨基酸长的BAFF结合肽，并且L2为肽连接体， 所述肽连接体不存在或为5至50个氨基酸长；以及（b)免疫球蛋白轻链。（a)的所述免疫 球蛋白重链和（b)的所述免疫球蛋白轻链可形成可结合B7RP1和/或可抑制人类T细胞的 B7RP1介导的增殖的IgG抗体，所述抗体包含（a)的所述多肽的两个分子和（b)的所述轻链 的两个分子。所述免疫球蛋白重链可在其C末端刚好L1的上游处缺失赖氨酸。所述IgG抗 体可为人类或人源化IgGl、IgG2、IgG3或IgG4抗体。所述BAFF结合肽P可具有氨基酸序列 SEQIDNO:1、SEQIDNO:2 或SEQIDNO:3。L1 可具有氨基酸序列SEQIDNO:4、37、38、 39或40。L2可具有氨基酸序列SEQIDNO:5、6或7。所述双特异性蛋白可包含包含氨基 酸序列SEQIDN0:8(RASQGISNWLA)的轻链CDR1、包含氨基酸序列SEQIDN0:9(AASSLQS) 的轻链CDR2、包含氨基酸序列SEQIDN0:10(QQYDSYPRT)的轻链CDR3、包含氨基酸序列SEQ IDN0:11(SYWMS)的重链CDR1、包含氨基酸序列SEQIDN0:12(YIKQDGNEKYYVDSVKG)的重 链CDR2以及包含氨基酸序列SEQIDN0:13(EGILWFGDLPTF)的重链CDR3。所述双特异性 蛋白可包含包含氨基酸序列SEQIDNO: 14的免疫球蛋白轻链可变区和/或包含氨基酸序 列SEQIDNO:15的免疫球蛋白重链可变区。所述双特异性蛋白可包含氨基酸序列SEQID NO:19或其变体和氨基酸序列SEQIDNO:17或18或其变体。所述变体序列相对于参考序 列可包含每100个氨基酸不超过10个单一氨基酸的缺失、插入或取代。
[0011] 另一方面，本文描述一种双特异性蛋白，其包含：（a)包含氨基酸序列SEQIDN0 : 17或SEQIDNO:18或其变体的多肽；以及（b)包含氨基酸序列SEQIDNO:19或其变体的 另一种多肽。所述变体序列相对于参考序列可包含每100个氨基酸不超过10个单一氨基 酸的缺失、插入或取代。所述双特异性蛋白可抑制人类B细胞的BAFF介导的增殖和人类T 细胞的B7RP1介导的增殖。所述双特异性蛋白可为包含（a)的所述多肽的两个分子和（b) 的所述多肽的两个分子的四聚体。
[0012] 在另一实施方案中，本文提供一种包含连接体的蛋白，所述连接体包含氨基酸序 列SEQIDN0 :6或SEQIDN0 :7。在一些实施方案中，这种蛋白可抑制人类B细胞的BAFF 介导的增殖和/或人类T细胞的B7RP1介导的增殖。所述蛋白可包含氨基酸序列SEQID NO:1、SEQIDNO:14和/或SEQIDNO:15。所述蛋白可包含包含由SEQIDNO:6或7分 离的SEQIDNO:1的至少两个拷贝的氨基酸序列。在另一实施方案中，所述蛋白可包括免 疫球蛋白轻链和免疫球蛋白重链，并且SEQIDN0 :6或7可在所述重链的C端的下游。在 所述实施方案中，SEQIDN0 :6或7可侧接结合于除所述重链和轻链所结合的蛋白以外的 蛋白的肽。
[0013] 此外，本文描述包含本文所述的双特异性蛋白或包含氨基酸序列SEQIDN0 :6或 7的蛋白中的任一者以及生理学上可接受的赋形剂的药物组合物。
[0014] 本文还描述编码本文所述的双特异性蛋白或包含SEQIDN0 :6或SEQIDN0 :7的 蛋白中的一者中所包括的任何多肽的核酸。编码双特异性蛋白中所包括的多肽的示例性核 酸包括例如SEQID勵：55、56、60、61、62以及63等。描述了包含所述核酸的载体和含有所 述载体和/或核酸的宿主细胞。本文进一步描述一种用于制造双特异性蛋白的方法，所述 方法包括在使得所述核酸被表达的条件下培养含有编码本文所述的双特异性蛋白中任一 者的核酸的宿主细胞，和从细胞团块或培养基回收所述蛋白。所述宿主细胞可为哺乳动物 细胞（例如CH0细胞），或细菌细胞（如大肠杆菌）。
[0015] 另一方面，本文描述一种用于治疗包括狼疮肾炎在内的全身性红斑狼疮的方法， 所述方法包括向患者施用治疗有效量的本文所述的双特异性蛋白或包含所述双特异性蛋 白的药物组合物中的任一者。另一治疗剂可在所述双特异性蛋白之前、之后或与其并行地 施用于所述患者。所述另一治疗剂可为皮质类固醇、抗疟药、视黄酸、NSAID、环磷酰胺、脱氢 表雄酮、吗替麦考酚酯、硫唑嘌呤、苯丁酸氮芥、甲氨蝶呤、他克莫司、氨苯砜、沙立度胺、来 氟米特或环孢霉素。
[0016] 另一方面，本文描述一种治疗方法，其包括向患者施用治疗有效量的本文所述的 双特异性蛋白或包含本文所述的双特异性蛋白的药物组合物中的任一者，其中所述患者具 有选自由以下组成的组的疾病：ANCA阳性血管炎、类风湿性关节炎（RA)、克罗恩氏病、溃疡 性结肠炎、乳糜泻、天疱疮、类天疱疮、亚急性皮肤红斑狼疮（SCLE)、多发性硬化、慢性发炎 性脱髓鞘性多发性神经病（CIDP)、重症肌无力、古德帕斯彻氏综合征、肾小球肾炎、自身免 疫性溶血性贫血（AIHA)、特发性血小板减少性紫癜（ITP)、慢性活动性肝炎、原发性胆汁性 肝硬化、干燥综合征、全身性硬化、桥本氏甲状腺炎、格雷夫斯病、阿狄森氏病以及多发性内 分泌腺瘤（MEN)。
[0017] 另一方面，本文描述包含本文所述的双特异性蛋白或包含SEQIDN0 :6或SEQID NO:7的蛋白中的任一者的药物组合物。所述药物组合物可例如用于治疗全身性红斑狼疮 或狼疮肾炎。
[0018] 另一方面，描述本文所提供的任何双特异性蛋白作为药剂的用途。
[0019] 附图简述
[0020] 图1 :结合于BAFF和B7RP1的双特异性蛋白的图。在顶行中列出各构建体的标识 符。在第二行中为与各构建体的结构有关的简要描述性短语。在底端行中为各构建体的结 构图。未填充的椭圆形表示免疫球蛋白重链或轻链的恒定区。由水平线填充的椭圆形表示 免疫球蛋白重链或轻链可变（VH或VL)区。小的实心填充的正方形和环表示BAFF结合肽。 铰链区以深色垂直线示出，而二硫桥以深色水平线示出。图1中"G4S"的序列以SEQIDN0: 72公开。
[0021] 图2 :人类B细胞增殖测定中双特异性蛋白的活性。图2A(顶部）和2B(底部）中 所示的数据来自如实施例1中所述执行的B细胞增殖测定。在两个图中，X轴指示测定混 合物中所含的双特异性蛋白的浓度（l〇g[nM])，并且y轴指示3H-胸苷摄取的量（每分钟计 数（cpm))。各符号的含义由针对所测定的各蛋白的标识符指示。所述标识符的含义在图1 中示出并且在实施例1中加以解释。
[0022] 图3 :人类T细胞增殖测定中双特异性蛋白的活性。所示的数据来自如实施例1 中所述执行的T细胞增殖测定。X轴指示测定混合物中的双特异性或CIB7RP1抗体的浓度 (l〇g[nM])，并且y轴指示相对于无B7RP1抑制剂的情况下的T细胞3H-胸苷摄取，在所指 示的浓度下的B7RP1抑制剂存在下T细胞3H-胸苷摄取的百分比（占对照的百分比）。指 示所测试的各蛋白的标识符。
[0023] 图4:用葡萄球菌肠毒素B(SEB)刺激的人类扁桃体细胞的细胞因子释放。方法描 述于实施例1中。y轴示出使用MesoScaleDiscovery(Rockville，Maryland)试剂盒根 据制造商的说明书测量的针对各种细胞因子所检测的信号的水平。细胞用aB7RPl(泳道 1)、P74293(泳道2)、CTLA4-Ig(泳道3)或人类IgG(泳道4)处理。本图中指示所测定的 细胞因子。
[0024] 图5:小鼠中双特异性构建体的药物代谢动力学分布。用于评估小鼠中P71617、 P71619、P71621、P71622、P74293以及P74294的体内药物代谢动力学特性的方法描述于实 施例1中。如实施例1中所解释，所述双特异性蛋白通过两种不同测定来检测，其中一种测 定仅检测所述蛋白的Fc部分（由填充菱形指示的数据点；Fc测定）并且其中一种测定检 测所述蛋白的Fc和BAFF结合部分（由填充正方形指示的数据点；完整测定）。X轴指示注 射后时间（小时），并且y轴指示在血清中检测的所述蛋白的浓度（ng/mL)。所注射的构建 体在各图中指示。
[0025] 图6A:结合于BAFF和B7RP1的鼠类代替物双特异性分子（"鼠类代替物"）对鼠类 B细胞增殖的抑制。所述测定如实施例2中所述执行。所述鼠类代替物包含抗鼠类B7RP1 IgG抗体，所述抗体具有连接于所述抗体的免疫球蛋白重链的C端的BAFF结合肽的两个拷 贝，如实施例2中所解释。阳性对照为BAFF结合肽体（"aBAFF")。来自所述鼠类代替物 和aBAFF的数据分别由实心填充的圆和正方形指示。X轴指示所述测定中这些测试蛋白的 浓度（log[pM])，并且y轴指示3H-胸苷并入（cpm)。
[0026] 图6B:所述鼠类代替物对结合于鼠类T细胞的B7RP1的抑制。所述测定如实施例 2中所述执行。抗鼠类B7RP1IgG抗体（"抗mB7RPl"）用作阳性对照。来自所述鼠类代替 物和抗mB7RPl的数据分别由实心填充的圆和正方形指示。X轴指示所述测定中这些测试蛋 白的浓度（l〇g[pM])，并且y轴指示结合于T细胞的鼠类B7RP1-FC的百分比。
[0027] 图7 :向小鼠施用绵羊红细胞对免疫学参数的体内效应。本图中所示的所有结果 均来自实施例2中所述的测定。用于处理小鼠的蛋白由如下各条形中的填充指示：未填充， 抗mB7RPl ;垂直线，a BAFF ;水平线，抗mB7RPl加a BAFF ;对角线，所述鼠类代替物；棋盘 形，mlgGl;以及实心填充（仅在底部图中），小鼠未用SBRC激发。顶部图，在用绵羊红细胞 (SRBC)激发的小鼠中的脾B细胞的百分比。y轴指示来自脾的作为B细胞的细胞的百分比。 中间图，在用SRBC激发的小鼠中作为记忆T细胞的脾CD4+T细胞的百分比。底部图，在来 自用SRBC激发的小鼠的血清中抗SRBC抗体的水平。
[0028] 图8A:用多种蛋白处理的NZB/NZW小鼠中的蛋白尿。方法描述于实施例2中。 针对各组小鼠的处理如下指示：填充圆，磷酸盐缓冲生理盐水（PBS);填充正方形，鼠类 IgGl(同型对照；5mg/kg);未填充正方形，抗mB7RPl(4.68mg/kg);填充的向上三角形， aBAFF(1. 88mg/kg);未填充的向上三角形，aBAFF(1. 88mg/kg)加抗mB7RPl(4. 68mg/kg); 以及未填充倒三角形，所述鼠类代替物（5mg/kg)。x轴指示小鼠的年龄（月），并且y轴指 示展现蛋白尿（即尿中彡300mb/dL蛋白）的小鼠的百分比。
[0029] 图8B:在用多种蛋白处理的8. 5月龄的NZB/NZW小鼠中针对双链DNA(dsDNA)的 抗体的水平。方法描述于实施例2中。X轴指示如下用于处理小鼠的分子的身份：1，抗 mB7RPl(4. 68mg/kg) ;2，aBAFF(1. 88mg/kg) ;3，aBAFF(1. 88mg/kg)加抗mB7RPl(4. 68mg/ kg) ;4,所述鼠类代替物双特异性（5mg/kg);以及5,mlgGl(同型对照；5mg/kg)。y轴指示 以阳性对照的百分比检测的抗dsDNA抗体的水平。各点指示来自单一小鼠的数据。
[0030] 图9A:NZB/NZW小鼠中抗dsDNAIgG的水平。方法描述于实施例2中。来自各组 小鼠的数据如下鉴定：1，接受抗mB7RPl(14mg/kg)的小鼠；2,接受aBAFF(5.6mg/kg)的小 鼠；3,接受抗mB7RPl(14mg/kg)和aBAFF(5.6mg/kg)的组合的小鼠；4,接受所述鼠类代替 物（15mg/kg)的小鼠；5,接受mlgG同型对照（15mg/kg)的小鼠；以及6,接受PBS的小鼠。 在泳道1、3以及4上方的星号指示在这些泳道中的数据与来自泳道5 (mlgG)的数据之间的 显著（*，P< 〇· 05;***，p< 0· 0001)差异。
[0031] 图9B:各