一种5基因缺失伪狂犬病重组病毒活疫苗及其制备方法
【技术领域】
[0001] 本发明设及一种5基因缺失伪狂犬病重组病毒活疫苗及其制备方法，属于兽用生 物制品领域。
【背景技术】
[0002] 伪狂犬病（Pseudor油ies，PR;又名Aujeszky'Sdisease,AD)是由伪狂犬病毒 (Pseudor油iesvirus,PRV)引起的一种急性传染病，可感染多种家畜、伴侣动物及野生动 物。猪是感染后可W存活的唯一物种，也是胆存宿主。感染猪主要表现为神经症状、流诞、 呼吸困难、母猪繁殖障碍、仔猪高死亡率等，给养猪业造成巨大的经济损失。
[0003] PRV是瘤疹病毒科、a瘤疹病毒亚科、水痘病毒属的成员，与其同属的还有I型牛 瘤疹病毒度HV-1)、马瘤疹病毒巧HV)W及水痘带状瘤疹病毒（VSV)。PRV基因组为线性双 股DNA，约145肺，由长独特区扣L)和短独特区扣巧及US两侧的末端倒转重复灯时与内 部重复（IR)组成，可编码70-100种蛋白质，成熟的病毒粒子约有50种蛋白。在上述基因 产物中，化区段中的gC、TK及US区段中的PK、gG、gl、姐、1化和28K为病毒增殖的非必需 成份，一般认为，TK、gC、姐、PK和CP(衣壳蛋白）等与PRV毒力相关。另外，瘤疹病毒基因 组中，UL49. 5编码的囊膜蛋白gN能抑制TAP介导的多肤转运到内质网，在病毒感染的细胞 内阻断MHCI类复合体的装配，从而下调MHCI类分子在细胞表面的表达，使得病毒有可能 逃避宿主CD8叮细胞的识别，并在宿主鼻腔及上呼吸道上皮细胞中复制，引起化脈性反应或 组织溃烂，进而导致细菌二次感染及严重的肺炎。最新研究表明（ShafiqulIetal，2014; HuiyougW，etal，2012) ,BHV-I病毒UL49. 5胞质尾缺失和胞外域30~40aa部分缺失能增 强病毒侵染宿主的能力，诱导更强的体液免疫和细胞免疫反应，在疫苗研制方面更具优势。 目前尚未见伪狂犬病毒在运方面有相关的研究报道。
[0004] 疫苗免疫接种是防制伪狂犬病的主要策略。伪狂犬疫苗主要分为=种：一是常 规疫苗，即灭活疫苗和弱毒活疫苗，如目前应用较多的Bartha-KGl株活疫苗；二是基因缺 失疫苗，即通过分子生物学方法，人工缺失某些基因，使其毒力减弱的同时又保留其免疫原 性。目前构建的伪狂犬病毒基因工程疫苗大多为TK、gl、姐、gG基因的单基因缺失或多基 因缺失突变株。PRV作为基因工程载体具备相当的优势=(I)PRV不感染人，具有很好的安全 性。现有的活疫苗株Bartha-Kei或'783'等在世界上已应用了几十年，未发生重大的安 全事故。（2)基因组容量大：在PRV长达145肺的基因组中，约一半基因被认为是非必需的， 如gI、姐、gM、TK、PK、gC和加TPase等，在运些区域可先后或同时插入和表达多种外源基因 而不显著影响其繁殖及免疫原性。（3)生产原材料来源方便，生产成本低：PRV疫苗可W接 种SPF鸡胚成纤维细胞及PK15、ST等传代细胞生产，原材料充足，生产工艺成熟，且PRV病 毒滴度很容易达到免疫要求，大大降低了生产成本。（4)免疫期长：PRVW细胞免疫为主，病 毒可W较长时间感染，外源基因可W在体内持续表达。（5)宿主范围广，多种家畜、经济动物 (如狐和貂）、伴侣动物及野生动物均可感染PRV，可研制针对不同动物的活载体疫苗。
【发明内容】
阳0化]本发明提供一种缺失姐、gI、US9、化49. 5、TK等5基因的伪狂犬病毒，用于制备伪 狂犬病活疫苗，预防伪狂犬病。
[0006] 本发明的技术方案
[0007] 1. -种伪狂犬病重组病毒活疫苗，其特征在于该活疫苗主要含有伪狂犬病毒 巧RV/姐/gl/US9/A化49. 5/TK株病毒，该毒株已于2015年11月11日送交北京市朝阳 区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生 物中屯、保藏，保藏编号为：CGMCCNo. 11500。
[0008] 2.如权利要求1所述的一种伪狂犬病重组病毒活疫苗，其特征在于该活疫苗含有 的伪狂犬病毒巧RV/姐/gl/US9 /A化49. 5/TK株病毒是同时缺失了姐基因、gl基因、 US9基因、TK基因和部分化49. 5基因的重组伪狂犬病毒株。
[0009] 3 -种5基因缺失伪狂犬病重组病毒活疫苗的制备方法，其特征在于所述的重组 伪狂犬病毒活疫苗是，将伪狂犬病毒巧RV/姐/gl/US9 /A化49. 5/TK株接种长满单层的 鸡胚成纤维细胞（CE巧，培养后，收获病毒培养物，加适宜稳定剂，经冷冻真空干燥制成疫 苗。
[0010] 4. 一种5基因缺失伪狂犬病重组病毒活疫苗的制备方法，其特征在于所述的培养 伪狂犬病毒5基因缺失株病毒巧RV/姐/gl/US9 /A化49. 5/TK株传代细胞是ST细胞/ 或PK15细胞/或适合该病毒生长的传代细胞，培养后，收获病毒培养物，加适宜稳定剂，经 冷冻真空干燥制成疫苗。
【具体实施方式】
[0011] -、生产用病毒株的构建 阳01引 1.载体
[0013] PMD-18T载体，用于克隆测序及转移载体的构建，购自宝生物工程（大连）有限公 司。含有GFP基因的载体pU-EGFP和含有RFP基因的载体pU-ERFP，均由本实验室保存。 4] 2.引物设计
[0015] 根据GenBank上发表的PRV序列设计合成W下引物：
[0016] (1)扩增gl基因左同源臂的引物：
[0017] US6F :5, -GACTTAAGGATCTCCGACCCGCAGGTGG-3'（序列 1)
[0018] US6R :5, -GACTTAAGGGAGCCGGGTCACGTCGCGCG-3'（序列 2)
[0019] 似扩增US9基因右同源臂的引物：
[0020] US2F :5, -GACTAGTATGGGGGTGACGGCCATCAC-3,（序列 3)
[0021] US2R :5, -GACTAGTCGGAGAGATCCTGCCGTCTAGG-3'（序列 4)
[0022] (3)扩增GFP基因的引物：
[0023] EGFP-F :5, -GGTATACGGATCCAAGGAGATATAACA-3'（序列 5)
[0024] EGFP-R :5' -GACTAGTGAGCTCTTAAAGCTCATCAT-3'（序列 6)
[0025] (4)扩增US9基因的引物：
[0026] PUS9-F :5' -AGAAACCGGAAGTGACGAATGG-3'（序列 7)
[0027] PUS9-R :5, -AGGAGCACCTGGTCGCAGAG-3'（序列 8)
[0028] (5)扩增化49. 5基因的引物（扩增含37-40aa基因片段）：
[0029] PUL50F:5, -GCCTGCAAGATGTAGCCGGAGA-3'（序列 9)
[0030] PUL50R:5, -TGGCGAGCGAGTGGGGTC-3'（序列 10) 阳0川 （6)扩增缺失A37-40aa基因的化49. 5部分基因的引物（引入AflII酶切位点， 用于化49. 5基因的连接）：
[0032] rPUL50F2 :5, -TAAGCTTGCCTGCAAGATGTAGCCGGAGA-3'（序列 11)
[0033] rPUL50R2 :5, -ACTTAAGTTAGGCGTAACCCAGGGCgAC-3,（序列 12)
[0034] (7)扩增化49. 5基因的引物（扩增缺失了CT的化49. 5部分基因片段）：
[0035] 巧UL49F:5, -TACTAGTAGATCGATCCGCACGCGC-3,（序列 13)
[0036] 巧UL49R:5, -AGAATTCGCAGCGTGGACACGAAG-3'（序列 14)
[0037] 巧UL49F2 :5' -ACTTMGATCGATCCGCACGCGC-3'(引入AflII酶切位点，用于UL49. 5 基因的连接）（序列15)
[00測 做扩增化49. 5基因左同源臂的引物：
[0039] UL50F:5, -TAAGCTTGCCTGCAAGATGTAGCCG-3'（序列 16)
[0040] UL50R:5, -ACTTAAGTTAGGCGTAACCCAG-3'（序列 17) 阳OW (9)扩增化49. 5基因右同源臂的引物：
[0042] UL48F: 5，-TACTAGTAGATCGATCCGCACGCGCCCG-3 '（序列 18)
[0043] UL48R:5, -AGAATTCGCAGCGTGGACACGAA-3'（序列 19) W44] (10)扩增TK基因左同源臂的引物：
[0045] UL24F :5, -GGTATACCCGTGGTCGTCACGCCCATGAA-3'（序列 20)
[0046] UL24R :5, -GGTATACATGCGCATCCCGGCGCGCTTC-3'（序列 21)
[0047](11)扩增TK基因右同源臂的引物：
[0048] UL22F :5, -GACTAGTATGCCCGCGTCGTCCGTGCGC-3,（序列 22)
[0049] UL22R :5, -GACTAGTGCGGTACGCCTCGGCGACGGT-3,（序列 23)
[0050] (12)扩增RFP基因的引物：
[0051] RFP-F :5, -GGTATACATGGTGAGCAAGGGCGAGGA-3'（序列 24)
[0052] RFP-R :5, -GACTAGTTTACTTGTACAGCTCGTCCATG-3'（序列 25)
[0053] 3.含GFP标记的伪狂犬缺失病毒（rPRV/姐/gl/US9 /GFP+)的构建
[0054] (1)转移载体PMD-US6-GFP-US2 的构建
[00对队本发明人由我国山西省太原市自行分离到的PRV做株）基因组为模板，采用引 物US6F/R和US2F/R分别扩增姐、gl、US9缺失的同源重组左同源臂和右同源臂；WpU-EGFP 为模板，用引物EGFP-F/EGFP-R扩增GFP基因。扩增目的片段分别连接PMD-18T载体，构建 相应的重组质粒。W訊n/Aflll双酶切左臂，WSpel/EcoRI双酶切右臂，回收相应片段后 依次与pMD-GFP质粒相应酶切后的片段连接，获得转移载体PMD-US6-GFP-US2。
[0056] 似同源重组 W57] 将转移载体PMD-US6-GFP-US2与PRV(SX株）亲本株共转染PK15细胞，按照LipofectamineTM2000转染试剂盒（Invitrogen公司）说明书（见附件1)进行转染。转 染24小时后，观察细胞病变及巧光蛋白表达情况。转染细胞裂解后盲传两代，仍有绿色巧 光表达，初步判断重组病毒捶救成功。 阳〇5引 （3)重组病毒的蚀斑纯化
[0059] 将初步获得的重组病毒接种已长成良好细胞单层的PK15细胞6孔细胞板，吸附1 小时后，弃去吸附液，铺上1 %的低烙点琼脂糖，继续培养。接种48小时后在巧光显微镜下 观察绿色巧光，挑选单个巧光蚀斑于ImlDMEM营养液中，冻融1次后，如此进行蚀斑纯化 3~4次，将获得的重组病毒命名为巧RV/姐/gl/US9 /GFP+。 柳6〇] (4)重组病毒巧RV/姐/gl/US9 /GFP+的鉴定
[0061] 采用姐、gI、US9和GFP基因特异性引物进行PCR扩增鉴定，结果发现未扩增出姐、 gl和US9片段，扩增出GFP