一种胶原蛋白海绵的制备工艺的制作方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种胶原蛋白海绵的制备工艺，属于于蛋白基生物材料领域。
【背景技术】
[0002]胶原是动物体内含量最多、分布最广的蛋白质。在哺乳动物中的含量是整个生物体自身总蛋白含量的1/4，在动物跟腱中即含有大量的胶原。胶原蛋白是一类蛋白质家族，现在已发现27种以上不同类型的胶原蛋白，其中I型、II型、III型以及IV型胶原蛋白是通过蛋白质水平上的一级结构分析发现的，其他则是通过在核酸水平上的胶原域的相似性分析发现的。胶原蛋白与其他蛋白质一样，也是由α-氨基酸组成的，并且具有1?4级结构和典型的三螺旋结构。胶原蛋白因其具有低免疫原性、细胞适应性和细胞增殖作用、组织相容性、可生物降解性等特性，而被广泛应用于制备止血敷料、人工皮肤、血管、神经、软骨、粘膜组织以及骨组织等领域的研究中。
[0003]现有工业生产的胶原蛋白海绵绝大部分是采用牛跟腱为原料的胶原蛋白制造的，而猪跟腱同牛跟腱一样含有优质的I型胶原蛋白，可以满足制备胶原蛋白的条件。但现在对于采用从猪跟腱料提取的胶原制备胶原蛋白海绵的技术却鲜有研究。而我国畜牧业发展迅速，全国猪肉年产量、肉制品及副产品加工总值逐年上升。我国是一个养猪大国，随着科学技术的不断发展，养猪业也得到了飞速的发展，猪出栏数和猪肉产量保持逐年增长的势头。在生猪产品的生产过程中大量的优质胶原蛋白源一一猪跟腱潜在的巨大价值被埋没。
【发明内容】
[0004]本发明的目的在于克服现有技术中存在的不足，提供一种一种胶原蛋白海绵的制备工艺，其以猪跟腱为原材料，采用酸酶结合提取胶原蛋白，可促进猪跟腱的深加工利用，避免猪跟腱潜在巨大价值的埋没浪费。
[0005]按照本发明提供的技术方案:一种胶原蛋白海绵的制备工艺，其特征在于包括如下步骤:
(1)猪跟腱颗粒的准备:将猪跟腱洗干净，粉碎成猪跟腱颗粒；
(2)猪跟腱颗粒的脱脂:将步骤(1)中制得的猪跟腱颗粒进行脱脂；
(3)酶解:将步骤(2)脱脂后的猪跟腱颗粒放入浓度为0.1%?0.5%的乙酸溶液中，并加入胃蛋白酶；猪跟腱颗粒和胃蛋白酶的放入比例为:每100?150毫克的0.1%?0.5%乙酸溶液中加入5?10克猪跟腱颗粒和1?5克的胃蛋白酶；然后将它们充分混匀，使用磁力搅拌在常温下浸泡30?60小时，获得酶解液；
(4)过滤:将步骤(3)获得的酶解液使用纱布过滤除渣，然后真空抽滤；
(5)离心:将步骤(4)过滤后的酶解液使用离心机进行离心，然后取上清液，上清液为胶原蛋白溶液粗品；
(6)透析:将步骤(5)获得的胶原蛋白溶液粗品先用0.05mol/L?0.155mol/L的乙酸溶液透析40?50小时，再以蒸馏水透析20?25小时，获得胶原蛋白溶液； (7)冷冻干燥:将步骤(6)透析好的胶原蛋白溶液用注射器注入冻干用的培养皿中，每个培养皿注入10?20ml ;然后放入冻干机中，冷冻干燥至零下40°C?50°C并抽真空升华12?15小时，制得胶原蛋白海绵；
(8)灭菌:将步骤(7)冷冻干燥成型的胶原蛋白海绵装入铝箔袋中，用封口机封口，然后用60Co进行辐照灭菌，即完成猪跟腱胶原蛋白海绵的制备。
[0006]作为本发明的进一步改进，所述步骤(1)中猪跟腱颗粒的获得方法具体为:将猪跟腱洗干净，沿着跟腱纤维方向切成厚度不超过5mm的薄片，然后再切碎、烘干，最后放入粉碎机中粉碎，获得猪跟腱颗粒。
[0007]作为本发明的进一步改进，所述步骤(2)中猪跟腱颗粒的脱脂方法具体为:将制得的猪跟腱颗粒放入滤纸包内，用长镊子将滤纸包放入抽提筒中，注入1?2倍一次虹吸量的石油醚，使样品包完全浸没在石油醚中；然后将抽提器各部分连接好，接通冷凝水水流，在水温为70?80°C的恒温水浴中进行脱脂抽提，抽提完毕后，用长镊子取出滤纸包，放通风处使石油醚挥发。
[0008]作为本发明的进一步改进，所述步骤(2)中进行脱脂抽提操作的抽提室室温为12 ?25Γ。
[0009]作为本发明的进一步改进，所述步骤(3)中所用的胃蛋白酶选用酶活力大于等于1200u/g的胃蛋白酶。
[0010]作为本发明的进一步改进，所述步骤(5)中离心的工艺参数为:离心机转速5000r/min，离心时间 90min。
[0011]作为本发明的进一步改进，所述胶原蛋白海绵制备工艺中的酶解到透析均是在温度为5?35°C、pH值为1.5?3的条件下进行。
[0012]本发明与现有技术相比，具有如下优点:本发明以猪跟腱为原材料，采用酸酶结合提取胶原蛋白，可促进猪跟腱的深加工利用，避免猪跟腱潜在巨大价值的埋没浪费。
【具体实施方式】
[0013]下面结合具体实施例对本发明作进一步说明。
[0014]实施例1
(1)、猪跟腱颗粒的准备:将猪跟腱洗干净，沿着跟腱纤维方向切成厚度不超过5mm的薄片，然后再切碎、烘干，最后放入粉碎机中粉碎，获得猪跟腱颗粒；
(2)、猪跟腱颗粒的脱脂:取步骤(1)中制得的猪跟腱颗粒25g放入滤纸包内，用长镊子将滤纸包放入抽提筒中，注入1.67倍一次虹吸量的石油醚，使样品包完全浸没在石油醚中；然后将抽提器各部分连接好，接通冷凝水水流，在水温为70°C的恒温水浴中进行脱脂抽提，抽提完毕后，用长镊子取出滤纸包，放通风处使石油醚挥发；脱脂抽提操作的抽提室室温为18°C ;
(3)酶解:将步骤(2)脱脂后的猪跟腱颗粒放入浓度为0.1%的乙酸溶液中，并加入酶活力多1200 u/g的胃蛋白酶；猪跟腱颗粒和胃蛋白酶的放入比例为:每100毫克的0.1%乙酸溶液中加入6克猪跟腱颗粒和1克的胃蛋白酶；然后将它们充分混匀，使用磁力搅拌在常温下浸泡50小时，获得酶解液；
(4)过滤:将步骤(3)获得的酶解液使用纱布进行过滤除渣，然后进行抽滤； (5 )离心:将步骤(4)过滤后的溶液使用离心机进行离心，离心机转速为5000r/min，离心时间90min ;然后取上清液，上清液为胶原蛋白粗品；
(6)透析:将步骤(5)获得的胶原蛋白粗品先用0.lmol/L的乙酸溶液透析45小时，再以蒸馏水透析23小时；
(7)冷冻干燥:将步骤(6)透析好的胶原溶液用注射器注入冻干用的培养皿中，每个培养皿注入15ml ;然后放入冻干机中，冷冻干燥至零下45°C并抽真空升华12小时，制得胶原蛋白海绵；
(8)灭菌:将步骤(7)冷冻干燥成型的胶原蛋白海绵装入铝箔袋中，用封口机封口，然后用60Co进行辐照灭菌，即完成猪跟腱胶原蛋白海绵的制备。
[0015]在实施例1中，所述胶原蛋白海绵制备工艺中的酶解到透析均是在温度为5?35°C、pH值为1.5?3的条件下进行。
[0016]
实施例2
(1)、猪跟腱颗粒的准备:采用实施例1制得的猪跟腱颗粒；
(2)、猪跟腱颗粒的脱脂:取猪跟腱颗粒25g放入滤纸包内，用长镊子将滤纸包放入抽提筒中，注入1倍一次虹吸量的石油醚，使样品包完全浸没在石油醚中；然后将抽提器各部分连接好，接通冷凝水水流，在水温为75°C的恒温水浴中进行脱脂抽提，抽提