一种可用于细胞粘附的水凝胶及其制备方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及水凝胶的制备技术领域，具体涉及一种可用于细胞粘附的水凝胶及其制备方法。
【背景技术】
[0002]理想的组织工程材料不仅需要具备支持并连接组织的网架结构，而且需要在调节组织发生和细胞的生理活动方面具有优势。目前大多数支架材料多采用生物大分子(壳聚糖，海藻酸盐，胶原蛋白)或合成高分子(聚乙二醇)等，用以提供支撑细胞生长的微环境。但化学残留，病源传播及合成成本等问题限制了其深入应用。
[0003]自然界中的谷氨酰胺转氨酶广泛存在于人体、高级动物、植物和微生物中，可以催化酰基转移反应，它能催化蛋白质中谷氨酰胺残基的γ-碳酰胺与赖氨酸的氨基之间形成共价键，形成ε-(γ-谷氨酰)赖氨酸异肽键，这种交联反应在自然界中主要发生在生物体内伤口愈合和以及形成和稳定细胞外基质的过程中。由于这种酶具有很高的催化活性，反应条件温和，同时依赖Ca2+，反应过程简单可控。因此可以被用于多肽自组装体的修饰，超分子结构的构筑等方面，有着广阔的生物应用前景。
[0004]目前，水凝胶的主要制备方法有物理交联和化学交联两种途径。物理交联型水凝胶的形成主要靠次级键价力的作用，因静电作用、氢键、疏水相互作用等的存在而形成的网络结构。但物理交联形成的水凝胶一般力学性能较弱，交联网络容易因离子强度、pH值和温度等外部环境的改变而破坏，一般不能满足组织工程的实际应用需要；化学交联型水凝胶通常运用传统的合成聚合物的方法或光聚合、辐射聚合等技术，引发共聚或缩聚反应产生共价键而形成的共价交联网络。在制备过程中往往需要大量使用光引发剂、交联剂以及有机溶剂等具有细胞毒性的添加剂，造成水凝胶具有较差的生物相容性，同时无引发剂的光引发方式不但效率相对较低，而且局部温度过热会损伤周围的细胞和组织。这种方法得到的水凝胶其生物学性能(如细胞粘附，迀移，分化等)会因原料分子、交联密度及亲疏水性各不相同。
【发明内容】
[0005]本发明的目的在于提供一种可用于细胞粘附的水凝胶及其制备方法，选用Ac-1IISLGK-NH2与左旋谷氨酰胺在酶促反应的作用下制备水凝胶，其以Ac-1IISLGK-NH 2作为支架，在酶促反应的作用下，将左旋谷氨酰胺(L-Gln)连接在纳米纤维表面，能够很好的促使细胞的粘附。
[0006]本发明的任务之一是提供一种可用于细胞粘附的水凝胶的制备方法。
[0007]—种可用于细胞粘附的水凝胶的制备方法，其是以Ac-1I1左旋谷氨酰胺在酶促反应的作用下形成的，其中，Ac-1IISLGK-NHd^N端乙酰化，C端氨基化，Ac-1 11311*-順2与左旋谷氨酰胺的摩尔比为1:1，Ac-1 IISLGK-NH 2的摩尔浓度为4?16mM，反应温度为37?40 °C，反应时间为24?48h。
[0008]作为本发明的一个优选方案，上述Ac-1IISLGK-NH2的摩尔浓度为7.27mM。
[0009]作为本发明的另一个优选方案，上述酶促反应中选用的混合液为谷氨酰胺转移酶溶液和含Ca2+的缓冲液。
[0010]优选的，上述谷氨酰胺转移酶溶液的制备方法为:
[0011 ] a配置底物溶液，将6L 7mg DTT溶于20mL 50mM Tris-HCl且pH为7.8缓冲溶液中，冷藏于4°C待用；
[0012]b取lmL所得底物溶液，将lmg 200U/g TG酶溶于该底物溶液中，即得lmL浓度为200U/mL的谷氨酰胺转移酶溶液。
[0013]优选的，上述含Ca2+的缓冲液是将6.17mg DTT和(λ Ollg CaCl 2溶于20mL纯水中制备得到的。
[0014]本发明的任务之二是提供上述制备方法得到的水凝胶。
[0015]上述水凝胶为具有网格状的纤维结构。
[0016]本发明所带来的有益技术效果:
[0017]从原料的选取上，本发明选用氨基酸组成较少的两亲性短肽Ac-1IISLGK_NH2作为支架，通过酶促反应将左旋谷氨酰胺(L-Gln)嫁接之上，从而使其形成酶催化水凝胶，为多肽的表面修饰提供了新思路，丰富了水凝胶的种类。
[0018]本发明涉及的两亲性短肽Ac-1IISLGK_NH2，氨基酸含量较少，本发明制备方法合成成本低，合成条件易于控制，且能诱导细胞粘附，即:本发明制备得到的水凝胶能使细胞很好的粘附在细胞表面(见说明书附图7)，同时制备得到的水凝胶毒性低、生物相容性好且不引起淋巴细胞产生非特异性免疫反应，是一类较为理想的纳米组织工程材料，对人类生命健康具有重要意义。
【附图说明】
[0019]下面结合附图对本发明做进一步说明:
[0020]图1为本发明两亲性短肽Ac-1I 1511*-见12在Tris_HCl溶液中的原子力显微镜形貌图；
[0021]图2为本发明两亲性短肽Ac-1I 1511*-见12在Tris_HCl溶液中的透射电子显微镜形貌图；
[0022]图3为本发明两亲性短肽Ac-1IISLGK-MV^ L_Gln在谷氨酰胺转移酶溶液中24小时后的原子力显微镜形貌图；
[0023]图4为本发明两亲性短肽Ac-1IISLGK-MV^ L_Gln在谷氨酰胺转移酶溶液中24小时后的透射电子显微镜形貌图；
[0024]图5、图6为本发明两亲性短肽Ac-1IISLGK-MV^ L_Gln在谷氨酰胺转移酶溶液中24小时后形成水凝胶的机械强度(存储模量和损耗模量)与频率之间的关系图；
[0025]图7为本发明两亲性短肽Ac-1IISLGK-MV^ L_Gln在谷氨酰胺转移酶溶液中24小时后形成水凝胶对MC 3T3细胞的粘附图；
[0026]图8为本发明两亲性短肽Ac-1IISLGK-MV^ L_Gln在谷氨酰胺转移酶溶液中24小时后形成水凝胶对淋巴细胞产生炎症因子的影响效果图。
【具体实施方式】
[0027]为了使本发明的优点、技术方案更加清楚、明确，下面结合具体实施例对本发明做详细说明。
[0028]首先对本发明制备方法及其性能检测中所用到的主要实验仪器的型号及规格做简要说明:
[0029]电热恒温孵育箱(DNP-9082，上海精宏试验设备有限公司);
[0030]干燥消毒烤箱(DHG-9246A，上海精宏试验设备有限公司)；
[0031]台式离心机(艾本德，德国)；
[0032]原子力显微镜(AFM)(Nanoscope Iva MultiMode AFM，布鲁克，德国)
[0033]透射电子显微镜(TEM) (JEM1400Plus，捷欧路，日本)
[0034]流变仪(MarsIII，哈克)
[0035]超净工作台(Airtech，江苏安泰)
[0036]恒温细胞培养箱(HERACELL 150i，赛默飞世尔，法国)
[0037]倒置显微镜(TS100，尼康，日本)
[0038]荧光倒置显微镜(DMI3000B，莱卡，德国)
[0039]一次性细胞培养瓶(25cm2，康宁)
[0040]一次性移液管(5mL，康宁)
[0041]一次性细胞培养板(3599，康宁)
[0042]一次性细胞培养板(3548，康宁)
[0043]液氮容器(YDS-30-125，东亚液氮容器)
[0044]微波辅助多肽合成仪(微波多肽自动合成仪，华盛昌)。
[0045]其次，对本发明所选用的主要原料做详细说明，本发明所选用的Ac-1IISLGK-NH2是自制的，其具体制备方法为:
[0046]步骤1、蒸馈N, N-二甲基甲酰胺(DMF)和呢啶(Piperidine)溶剂
[0047]将购买的DMF溶液在60°C条件下减压蒸馏，去除蒸馏前后液各10mL左右，得到纯的DMF溶剂；将购买的哌啶中加入少量CaHdP热回流1_2小时，接收沸点温度(106°C )的馏分，得到纯的哌啶溶剂；
[0048]步骤2、氨基酸、树脂、活化剂、盖帽剂、去保护剂等的配制
[0049]多肽固相合成仪上计算出制备0.25mM Ac-1IISLGK-NH2所需氨基酸和其他试剂的用量(为保证多肽合成时，两亲性短肽的纯度，氨基酸的用量加倍，其终浓度为0.2M):
[0050]Lys (赖氨酸):1.03g 溶于 1 lmL DMF 中；
[0051]Gly (甘氛酸):0.65g 溶于 llmL DMF 中；
[0052]lie (异亮氨酸):2.26g 溶于 32mL DMF 中；
[0053]Leu(亮氨酸):0.78g 溶于 llmL DMF 中；
[0054]Ser (丝氛酸):0.84g 溶于 llmL DMF 中；
[0055]树脂(载量为0.6mmol/g):0.417g ；
[0056]注意:氨基酸的a-氨基均为Fmoc保护，Lys的侧链氨基也被保护；
[0057]活化剂:苯并三氮唑-N，N, N’，N’ -四甲基脲六氟磷酸酯(HBTU):5.29g ； 1_羟基苯并三唑(Η0ΒΤ):1.88g ;溶于 3 lmL DMF ；
[0058]活化碱:N,N- 二异丙基乙胺(DIEA):5.57mL ；DMF:10.43mL ；
[0059]盖帽剂:乙酸酐:2.2ml ；N, N_ 二异丙基乙胺(DIEA):0.239g ；H0BT:0.022g ;溶于8.8mL DMF 中；
[0060]裂解剂:三氟乙酸(TFA):14.25mL ;三异丙基硅烷(TIS):0.375mL ；H20:0.375mL ；
[0061]去保护剂:哌啶:39.6mL ；DMF:158.4mL ；1-羟基苯并三唑(HOBT):2.67g ；
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