用于蛋白质药物失活的抗体锁扣的制作方法
【技术领域】
[0001] 本
【发明内容】
通常涉及一种用作治疗多种医学状况的治疗剂的抗体靶向 (antibody-based)分子。更具体地，本
【发明内容】
涉及铰链抗体，所述铰链抗体在目标细胞或 组织中被选择性激活，以治疗其中的医学状况。
【背景技术】
[0002] 抗体靶向治疗剂，包括单克隆抗体，是作为有效治疗多种疾病的主要类别的药物 中的一种出现的。在2012年，全球销量前10的药物中，5种是治疗性抗体，包括HUMIRA?， REMICADE?，RITUXAN?，HERCEPTIN?和AVASTIN?。该5种药物在全球的总收入达到约450 亿美元，接近该年全球抗体靶向治疗剂市场的60%。当现有的产品扩宽它们的批准使用范 围，且新的准入者进入市场时，全球市场有望于持续增长。
[0003] 尽管该领域持续发展，要给市场带来更有效更负担得起的抗体靶向候选物仍然有 许多挑战。目前抗体靶向治疗剂相关的一大问题是：作用位点的弱选择性。单克隆抗体和 可溶性蛋白能够特异性结合且中和它们意向的目标分子（例如，抗原和细胞表面受体）。但 是，大部分目标分子对疾病位点是非特异的，它们可能存在于除了疾病位点之外的细胞或 组织。因此，这些治疗剂可能在那些非病的正常细胞或组织发生作用。这些脱靶作用可能 导致不想要的副作用。因此，期望发展高精准性的抗体靶向治疗剂。
[0004] 避免脱靶作用和提高选择性的一个可能的方案是提供可在目标位点激活 的前抗体（pro-antibody)。例如，专利号为No. 8, 399, 219的美国专利以及公开号 为No. 2010/0189651的美国专利申请公开了一种蛋白酶激活的抗体，该抗体通过肽饰 (peptidemask)或修饰部分（maskingmoiety)进行了修饰。在这些申请文件中，采用了· 菌体展示技术筛选能够抑制/减弱功能性抗体与其结合靶标的结合的肽或部分。但是，采 用这些方法获得的修饰部分不能广泛用于所有抗体，因为它们是基于其对特异性靶标的抑 制能力而确定的。因此，针对这些方法有必要发展一种能用于每种抗体靶向治疗剂的修饰 部分，这是非常耗时、昂贵和复杂的。此外，修饰部分的引入给受试者带来了诱导不必要的 免疫应答的风险。
[0005][0006] 鉴于上述内容，本领域存在提供下一代治疗剂的需要，该治疗剂被精心设计和处 理，以具有，例如，改善的作用位点选择性以及增强的效力等特性。进一步地，这些设计和处 理方案将应用于多种抗体靶向治疗剂，且不会引起不需要的免疫应答。
【发明内容】
[0007] 接下来对本
【发明内容】
进行简单的概述，为读者提供基本的理解。该概述并非是本
【发明内容】
广泛的综述，也没有定义本发明的关键/决定性要素，或描绘本发明的保护范围。 该概述唯一的目的在于以简单的形式呈现本文中公开的一些概念，作为之后更加详细的描 述的前奏。
[0008] -方面，本发明意在一种铰链抗体。该抗体靶向的治疗剂能够在目标细胞或组织 中被选择性激活，以治疗目标细胞或组织中的状况。
[0009] 根据本发明的各种实施例，铰链抗体含有功能性抗体，两个抑制性结构域以及四 个可裂解的接头。所述功能性抗体在激活状态下能够治疗状况，其具有两条轻链和两条重 链。两个抑制性结构域中每一个均由通过二硫键相互连接的两个肽臂组成。每个抑制性结 构域由两个通过二硫键相互连接的肽臂组成。四个可裂解的接头中的每一个含有被在目标 细胞或组织中特异性或高度表达的酶裂解的肽底物。每个可裂解的接头连接所述两个抑制 性结构域的两个肽臂中的一个至功能性抗体的两条轻链和两条重链中的一个的N末端。
[0010] 根据本发明的某些实施例，两个抑制性结构域中的每一个均是免疫球蛋白 A(IgA)、免疫球蛋白D(IgD)或免疫球蛋白G(IgG)的铰链区或铰链区的片段。例如，抑制性 结构域可能包括以下序列中的任一种序列：IgG的SEQIDNos. 10，11，12，13;IgA的SEQID Nos. 14,15 ;以及IgD的SEQIDNos. 54, 55〇
[0011] 在可选的实施例中，功能性抗体是anti-TNF-α抗体，anti-RANKL抗体， anti-CTLA-4 抗体，anti-HER2 抗体，anti-EGFR抗体，anti-VEGF抗体，anti-VEGFR2 抗体， anti_IL6R抗体，anti_IL12/23 抗体，anti_CD3 抗体，anti-CDlla抗体，anti_CD20 抗体， anti-⑶25抗体，anti-⑶30抗体，anti-⑶33抗体或anti-⑶52抗体。例如，功能性抗体的 轻链的氨基酸序列是SEQIDNos. 1，2,3,4,5,6,7,8和9中任一种氨基酸序列；而功能性抗 体的重链的氨基酸序列是SEQIDNos. 58, 59,60,61，62,63,64,65和66中的任一种氨基酸 序列。
[0012] 在某些实施例中，所述肽底物被以下任一种酶裂解：基质金属蛋白酶（MMP)，组织 蛋白酶（CTS)，半胱天冬酶（CASP)或整合素样金属蛋白酶（ADAM)。例如，根据一些实施例， 酶是MMP-2或MMP-9,每个可裂解的接头包含氨基酸序列SEQIDNo. 6。
[0013] 根据本发明的某些实施例，功能性抗体是anti-TNF-α抗体，其具有含有氨基酸 序列SEQIDNo. 1的轻链和含有氨基酸序列SEQIDNo. 58的重链，每个可裂解的接头包括 氨基酸序列SEQIDNo. 16 ;每个抑制性结构域含有氨基酸序列SEQIDNo. 10。
[0014] 在另一方面，本发明意在产生本发明上述方面/实施例中的铰链抗体的表达系 统。
[0015] 根据本发明的多个实施例，用于产生铰链抗体的表达系统包括第一核酸序列和第 二核酸序列。第一核酸序列，从5'到3'端包括第一抑制性结构域编码区，第一可裂解的接 头编码区以及轻链编码区。所述第一抑制性结构域编码区编码上述任一铰链抗体的抑制性 结构域的第一肽臂。第一可裂解的接头编码区编码上述铰链抗体的可裂解的接头，所述可 裂解的接头是可被在目标细胞或组织中特异性或高度表达的酶裂解的肽底物。轻链-编码 区编码上述铰链抗体的功能性抗体的轻链，其中所述功能性抗体在激活状态下能够治疗状 况。第二核酸序列，从5'到3'端包括第二抑制性结构域编码区，第二可裂解的接头编码区 以及重链-编码区。所述第二抑制性结构域编码区编码铰链抗体的抑制性结构域的第二肽 臂。第二可裂解的接头编码区编码铰链抗体的可裂解的接头。重链编码区编码铰链抗体的 功能性抗体的重链。
[0016] 在本发明的某些可选实施例中，第一和第二核酸序列可以在单一表达载体中构 建。例如，表达系统可能进一步包括连接核酸序列，所述连接核酸序列连接所述第一核酸序 列和第二核酸序列。连接核酸序列的非限制性实施例包括编码Furin-2A多肽的序列或编 码内部核糖体进入位点（IRES)序列的序列。
[0017] 在第一和第二核酸序列是在单一表达载体中构建的情况下，表达系统可能进一步 可选地包括可操作地连接到第一核酸性序列和第二核酸序列的调控序列，以调控第一核酸 序列、第二核酸序列以及可选的连接核酸序列在宿主细胞中的翻译。任选地，表达系统可能 包括至少两段分别可操作地连接到第一和第二核酸性序列的调控序列，以分别调控第一和 第二核酸序列的表达。
[0018] 在一些其他实施例中，第一和第二核酸序列可能在两个单独的表达载体中构建。 例如，第一核酸序列与可操控地连接的第一调控序列一起在第一表达载体中构建，而第二 核酸序列与可操控地连接的第二调控序列一起在第二表达载体中构建。第一和第二表达载 体随后被转移到相同的宿主细胞或不同的宿主细胞中，并在相同的宿主细胞或不同的宿主 细胞中表达。
[0019] 根据本发明的某些实施例，抑制性结构域是免疫球蛋白A(IgA)、免疫球蛋白 D(IgD)或免疫球蛋白G(IgG)的铰链区或铰链区的片段。
[0020] 根据本发明的多个实施例，表达载体编码上述铰链抗体中的任一种。例如，当表达 系统是通过单一构建体进行时，该构建体的核酸序列可以是SEQIDNos. 17,18,19, 20, 21， 22, 23,24, 25,26, 27,28,29,30,31，32,33,34, 35,36,37,38,39, 40,41，42,43,44, 45,46， 47,48,49和50中的任一种。在表达载体是以两个载体（或两个质粒）系统进行的情况下， 第一核酸序列是SEQIDNos. 67,69,71，73,75和77中的任一种；而第二核酸序列是SEQID Nos. 68, 70, 72, 74, 76 和 78 中的任一种。
[0021] 在另一方面，本发明意在一种适用于制备本发明上述方面/实施例的铰链抗体的 重组载体。
[0022] 根据本发明的某些实施例，重组载体包括根据本发明上述方面/实施例的人工合 成核酸和一段或多段可操控地连接所述人工合成核酸分子的调控序列，从而使得所述载体 在合适的条件和在合适的宿主细胞中能够表达本发明上述方面/实施例的铰链抗体。
[0023] 在再一方面，本发明意在一种治疗受试者，尤其是患有癌症或自身免疫疾病的受 试者的方法。
[0024] 根据本发明的一些实施例，该方法包括给受试者施用有效治疗剂量的本发明上述 方面/实施例的铰链抗体。例如，所述铰链抗体可以口服，皮下注射，静脉内注射，鞘内注射 或肌内注射给药给受试者。
[0025] 参考以下具体描述和附图，将会更好地理解本发明的许多所附特性和优势。
【附图说明】
[0026] 通过以下根据附图所理解到的详细描述将会更好地理解本说明书，其中：
[0027] 图1是描述本发明某些实施例的铰链抗体的结构的示意图；
[0028] 图2是描述本发明实施例的铰链抗体的设计方案的示意图；
[0029] 图3是描述编码本发明某些实施例的铰链抗体的核酸分子的示意图；
[0030] 图4是描述本发明一个实施例的铰链抗体的总体结构的示意图；
[0031] 图5是本发明的一个作用实施例的SDSPAGE凝胶图谱；
[0032] 图6是本发明的一个作用实施例的两个SDSPAGE凝胶图谱；
[0033] 图7是描述本发明的一个作用实施例的各种抗体的结合能力的柱状图；
[0034] 图8是描述本发明的一个作用实施例的TNF-α信号的柱状图；
[0035] 图9是描述本发明的另一个作用实施例的各种抗体的结合能力的柱状图；
[0036] 图10是描述本发明的另一个作用实施例的各种抗体的结合能力的柱状图；
[0037] 图11提供了描述本发明的一个实施例中铰链-aEGFR抗体在小鼠肿瘤位点体内 定位和激活的照片；
[0038] 图12是指示铰链-TNFa抗体对胶原蛋白诱导的关节炎的消炎效果的线状图表。
[0039] 依据常规实践，各种描述的特征/要素并不是为了标示范围，而是为了最好地标 示本发明相关的特定特征/要素。而且，各个附图中的附图标记和名称也用于指示类似的 要素/部分。
【具体实施方式】
[0040] 以下提供的与附图相关的详细描述意在作为本发明实施例的描述，并不意在表示 本发明实施例仅仅只能通过一种形式进行或利用。该描述阐述了实施例的作用，进行和操 作实施例的步骤顺序。但是，不同的实施例可能伴随着相同或等同的作用和顺序。
[0041] 为了方便起见，本说明书、实施例和所附权利要求书中采用的某些术语在此被统 一。除非另有说明，本文所用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人 员的常规理解相同的含义。
[0042] 除非另有说明，本发明所采用的科学和技术术语具有本领域普通技术人员常规理 解和使用含义。除非上下文需要，应该理解单数术语包括同一术语的复数形式，复数形式也 包括单数形式。特别是，在本说明书和权利要求书中，单数形式的"一" "一个"包括复数形 式，除非上下文有明确指出。而且，在本说明书和权利要求书中，术语"至少一个"和"一个 或多个"具有相同的含义，包括一个、两个或多个。
[0043] 尽管阐述本发明保护范围的数值范围和参数是近似值，在特定实施例中阐述的数 值已尽可能精确地报道。但是，任何数值固有地必定具有一定的误差，这些误差来源于各自 测试计量中存在的标准偏差。而且，本发明所用的术语"约"通常意味着在给定数值或范围 内10%，5%，1%或0.5%。可选地，从本领域普通技术