一种含阿霉素七肽多孔微球的制备方法
【技术领域】
[0001]本发明属于多孔微球领域，特别涉及一种含阿霉素七肽多孔微球的制备方法。
【背景技术】
[0002]由于多肽具有不同的化学结构，可以利用其肽键间氢键作用、静电作用、疏水性作用以及31-31堆积作用等实现分子自组装，自发组合形成具有某种理化性能的分子聚集体或超分子结构。近年来多肽的自组装逐渐成为材料学和生物医学等领域的研究热点，一系列可自组装的离子短肽被发现或者被设计出来，获得了各种各样的自组装结构，包括纤维、膜和水凝胶等。多肽是生物体内固有的生物活性分子，具有良好的生物相容性和降解性，利用多肽自组装技术构建的各种功能性材料在药物控制释放、组织工程支架材料以及基因治疗等领域内有着巨大的应用前景。
[0003]盐酸阿霉素(Doxorubicin，D0X)属蒽环类抗肿瘤抗生素，是一种抑制DNA和RNA合成的抗肿瘤药物。其对实体瘤的有效率约达70%，主要用于治疗恶性淋巴瘤、急性白血病、肺癌、乳腺癌、骨及软组织肉瘤、头颈部肿瘤、肝癌、食道癌、胃癌等，抗瘤谱广，应用广泛。然而，盐酸阿霉素也有着传统抗癌药物的不良反应，主要是消化道毒性、骨髓抑制、心脏毒性、脱发等问题，少数患者有发热、肝功能损伤与肌红蛋白尿、红斑以及色素沉着。因此，开发一种具有很好的生物相容性和可降解性，同时又能实现高效载阿霉素及其可控释放的生物材料很有必要。
【发明内容】
[0004]本发明所要解决的技术问题是提供一种含阿霉素七肽多孔微球的制备方法，该方法操作简单、反应条件温和，制备得到的载药复合物包封率高，且具有较好的释放特性。
[0005]本发明的一种含阿霉素七肽多孔微球的制备方法，包括:
[0006](1)将七肽Fmoc-HP溶于1，1，1，3，3，3，-六氟-2-丙醇溶液中，得到Fmoc-HP溶液；将D0X加入到PTA水溶液中，得到含D0X的混合溶液；D0X的浓度范围为0.1?5mg/ml ;
[0007](2)将步骤⑴中D0X的混合溶液加入到步骤⑴中Fmoc-HP溶液中，避光静置，离心，冷冻干燥，得到DOXOFmoc-HP/PTA载药复合物，即含阿霉素七肽多孔微球；其中，避光静置的时间为2?24小时，Fmoc-HP和PTA总质量与D0X的质量比为5:1?1: 1。
[0008]所述步骤(1)中七肽的序列为Fmoc-1le-Gln-Ser-Pro-His-Phe-Phe。
[0009]所述步骤(1)中Fmoc-HP的浓度范围为0.03?0.48M，PTA的浓度范围为
0.025X 10 3?0.8X10 3M。
[0010]所述步骤(2)中加入为迅速加入。
[0011]所述步骤(2)中离心的转速为lOOOOrpm，离心时间为5?10分钟；离心除去未包裹的D0X。
[0012]所述步骤(2)中DOXOFmoc-HP/PTA载药复合物分散于PBS缓冲液中，置于透析袋，放入PBS缓冲溶液环境中的溶出仪，于不同时间点取样测吸光度，并补充缓冲液，测试药物释放；其中，所述PBS缓冲液的pH为7?7.5 ;透析工艺为采用透析袋，内外液均为PBS缓冲液。
[0013]所述步骤⑵中DOXOFmoc-HP/PTA载药复合物用于L-929细胞培育，测试细胞毒性；其中，在测试细胞毒性的过程中，DOXiFmoc-HP/PTA的PBS溶液中含D0X浓度为0?40 μ Μ。
[0014]有益效果
[0015](1)本发明利用Fmoc-HP和PTA自组装过程中对D0X的化学吸附及物理包裹，制备了含D0X的多肽自组装复合材料，制备方法简单、实验条件温和；
[0016](2)本发明所使用的载体材料本身具有很好的生物相容性和可降解性，所制备的阿霉素七肽多孔微球复合材料药物包封率高；
[0017](3)本发明所制备的阿霉素七肽多孔微球可以通过调控环境的pH值使载体的降解和药物的释放同步进行。
【附图说明】
[0018]图1为实施例1中(a) DOXiFmoc-HP/PTA的SEM图；(b)释药20天后的SEM图；(c)DOXiFmoc-HP/PTA荧光显微镜照片；
[0019]图2为实施例1中D0X在不同质量比下的上载率和包封率图；
[0020]图3为实施例2中D0X@Fmoc-HP/PTA在PBS缓冲溶液环境下D0X的释放曲线图；
[0021]图4为实施例3中(a) D0X@Fmoc-HP/PTA的细胞毒性图；(b) Fmoc-HP/PTA细胞毒性图。
【具体实施方式】
[0022]下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
[0023]实施例1
[0024](1)分别取 lml D0X 浓度为 1.6、0.8、0.4 和 0.2mg/ml 的 PTA (0.6mg/ml)溶液，迅速加入到10 μ 1的Fmoc-HP (lmg/ml)溶液(1，1，1，3，3，3，-六氟-2-丙醇溶液)中，铝箔纸避光，室温下静置反应4h。然后将含D0X的多肽自组装溶液lOOOOrpm下离心5min，并用去离子水洗涤数次，除去未包裹的D0X。
[0025](2)取制备好的DOXOFmoc-HP/PTA于硅片上，自然风干，喷金制样后用于SEM测试，图 Ι-a 为 D0X@Fmoc-HP/PTA 的 SEM 图；图 l_b 为释药 20D 后的 SEM 图；另取 D0X@Fmoc-HP/PTA于载玻片上，自然风干，用于荧光显微镜测试；图Ι-c为DOXOFmoc-HP/PTA的荧光显微镜图。
[0026](3)收集所有(1)中离心洗涤后的残液，用紫外-可见分光光度计测其在波长481nm处的吸光度，通过标准曲线方程计算出未上载的D0X的量，计算出D0X的上载率和包封率。图2为Fmoc-HP和PTA与D0X在不同质量比时的上载率和包封率图，当Fmoc-HP和PTA与D0X质量比为2:1，D0X浓度为0.8mg/ml时，上载率和包封率均较高。
[0027]实施例2
[0028](1)取lml D0X浓度为0.8mg/ml的PTA (0.6mg/ml)水溶液，迅速加入到10 μ 1的Fmoc-HP (lmg/ml)六氟异丙醇溶液中，铝箔纸避光，室温下静置4h，然后将含D0X的多肽自组装溶液lOOOOrpm下离心5min，将未包裹的D0X除去。最后，将沉淀冷冻干燥后获得D0X0Fmoc-HP/PTAο
[0029](2)称取1.8mg干燥好的载药复合物于2ml PBS缓冲液中，充分分散后放入透析袋(MW = 8，000?14，000)，并将透析袋放置在PBS环境下的溶出仪中，补加10ml的PBS溶液作为外液，溶出仪温度设为37°C，转速为90转/分。分别于lh、2h、4h、6h、8h、12h、24h、48h、72h取出lml透析液，并回补lml相应的PBS缓冲溶液。用紫外_可见分光光度计对取出的透析液进行吸光度检测，吸收波长设为481nm，收集数据并计算药物释放情况，图3为该条件下D0X的释放曲线图。
[0030]实施例3
[0031](1)取lml D0X浓度为0.8mg/ml的PTA(0.6mg/ml)水溶液，迅速加入到10 μ 1的Fmoc-HP (lmg/ml)六氟异丙醇溶液中，铝箔纸避光，室温下静置反应4h。然将含D0X的多肽自组装溶液lOOOOrpm下离心5min，将未包裹的D0X除去。
[0032](2)取 lml PTA (0.6mg/ml)水溶液，迅速加入到 10 μ 1 的 Fmoc-HP (lmg/ml)六氟异丙醇溶液中，室温下静置4h。然后将多肽自组装溶液lOOOOrpm下离心5min。最后，将沉淀与(1)中的沉淀一起进行冷冻干燥，分别获得干燥的D0X@Fmoc-HP/PTA和Fmoc-HP/PTA。
[0033](3) DOXiFmoc-HP/PTA 和 Fmoc-HP/PTA 细胞毒性实验:称取 1.3mg D0X 溶于 PBS 溶液中，配制成浓度为4、2、1和0.5 μΜ的D0X溶液。称取2.lmg D0X@Fmoc-HP/PTA，配制成含D0X量为4、2、1和0.5 μ Μ的PBS溶液。另外，称取1.6mg Fmoc-HP/PTA,配制成浓度为6.8236、3.4118、1.7059 和 0.8529mg/L 的 PBS 溶液，与前面 DOXiFmoc-HP/PTA 溶液中所含Fmoc-HP/PTA的量对等。
[0034](4)将(3)中的溶液灭菌后，测其对L-929细胞的毒性，以PBS处理的细胞作为对照组。图4-a为L-929细胞分别用PBS、D0X和D0X@Fmoc-HP/PTA溶液培育24h后的细胞存活率图，从图上可以看出，随着D0X浓度的增加，实验组细胞毒性均增强，表明DOXOFmoc-HP/PTA制备成功，并且能有效的释放D0X ;图4-b为L-929细胞分别用PBS和Fmoc-HP溶液培育24h后的细胞存活率图，从图上可以看出，当Fmoc-HP/PTA溶度在0.8529?3.4118mg/L时，细胞存活率均高于PBS对照组，当溶度为6.8236mg/L时，细胞存活率略低于对照组，表明Fmoc-HP/PTA具有很好的生物相容性，显示了其作为药物载体的优越性。
【主权项】
1.一种含阿霉素七肽多孔微球的制备方法，包括: (1)将七肽Fmoc-HP溶于1，1，1，3，3，3，-六氟-2-丙醇溶液中，得到Fmoc-HP溶液；将D0X加入到PTA水溶液中，得到含D0X的混合溶液，D0X的浓度范围为0.1?5mg/ml ; (2)将步骤(1)中D0X的混合溶液加入到步骤(1)中Fmoc-HP溶液中，避光静置，离心，冷冻干燥，得到DOXOFmoc-HP/PTA载药复合物，即含阿霉素七肽多孔微球；其中，避光静置的时间为2?24小时，Fmoc-HP和PTA总质量与D0X的质量比为5:1?1: 1。2.根据权利要求1所述的一种含阿霉素七肽多孔微球的制备方法，其特征在于，所述步骤(1)中七肽的序列为 Fmoc-1le-Gln-Ser-Pro-His-Phe-Phe。3.根据权利要求1所述的一种含阿霉素七肽多孔微球的制备方法，其特征在于，所述步骤(1)中Fmoc-HP的浓度范围为0.03?0.48M，PTA的浓度范围为0.025X 10 3?0.8X10 3Mo4.根据权利要求1所述的一种含阿霉素七肽多孔微球的制备方法，其特征在于，所述步骤(2)中离心的转速为lOOOOrpm，离心时间为5?10分钟。5.根据权利要求1所述的一种含阿霉素七肽多孔微球的制备方法，其特征在于，所述步骤(2)中DOXOFmoc-HP/PTA载药复合物分散于PBS缓冲液中，置于透析袋，放入PBS缓冲溶液环境中的溶出仪，于不同时间点取样测吸光度，并补充缓冲液，测试药物释放。6.根据权利要求1所述的一种含阿霉素七肽多孔微球的制备方法，其特征在于，所述步骤(2)中DOXOFmoc-HP/PTA载药复合物用于Hela细胞培育，测试细胞毒性。
【专利摘要】本发明涉及一种含阿霉素七肽多孔微球的制备方法，包括：将七肽Fmoc-HP溶于1,1,1,3,3,3,-六氟-2-丙醇溶液中，得到Fmoc-HP溶液；将DOX加入到PTA水溶液中，得到含DOX的混合溶液；将DOX的混合溶液加入Fmoc-HP溶液中，避光静置，离心，冷冻干燥，即得。本发明的得到的多孔微球载药复合物具有很好的生物相容性和可降解性，以及较好的载药及药物缓释效果，用于药物控制释放研究，有着很好的实用价值。
【IPC分类】A61P35/00, A61K47/42, A61K31/704, A61K9/19
【公开号】CN105395491
【申请号】CN201511024595
【发明人】聂华丽, 肖瑞秋, 陈健良
【申请人】东华大学, 佛山市迭蓓丝生物科技有限公司
【公开日】2016年3月16日
【申请日】2015年12月30日