小分子RNAhsa-miR-874在制备治疗胶质母细胞瘤药物中的应用

文档序号:9653661阅读:540来源:国知局
小分子RNA hsa-miR-874在制备治疗胶质母细胞瘤药物中的应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物技术研究领域,设及制备抗胶质母细胞瘤药物的miRNA,特别设及 与胶质母细胞瘤相关的小分子RNAhsa-miR-874在杀伤GBM中的干细胞及非干细胞肿瘤等 方面的用途。
【背景技术】
[000引胶质母细胞瘤(glioblastoma,GBM)是恶性度最高,无法治愈的脑肿瘤η气近 年来的研究证实胶质母细胞瘤中存在一些具有干细胞特性的肿瘤细胞一胶质瘤干细胞 (gliomastemcell,GSC)w?,它们是胶质母细胞瘤难W治愈的主要原因《。胶质瘤干细 胞具有极强的成瘤性,对常规放化疗有更强的耐受性,其所携带的基因突变和一般肿瘤细 胞有所不同ηW。因此开发针对胶质瘤干细胞的药物或疗法已经成为当前胶质母细胞瘤研 究的重点;发现既对胶质瘤干细胞,又对胶质瘤细胞起作用的分子对于胶质母细胞瘤的治 疗研究具有重要意义。
[0003] 在胶质瘤干细胞药物研究中,近年来微RNA(microRNA或miRNA)逐渐被众多研究 者所重视w'l2^。miRNA成为研究热点的主要原因是:1)可W调控上百个基因,能在系统水 平上对细胞进行调控;2)只有21 - 23个核巧酸,可W作为易吸收的小分子药物;3)更加容 易合成,作为药物的成本较低;4)细胞本身就具有的一种小分子,可W避免潜在的免疫(排 斥)反应;5)可W由细胞释放入血液,更加易于血液检测和诊断。
[0004]miRNA是一种非编码RNA,由细胞核内的基因转录而来,最后在细胞质内形成大小 约为22个核巧酸的单链RNA。miRNA可W和mRNA的3'端非翻译区(3'UTR)结合,从而达 到减少蛋白翻译的作用目前已经探明miRNA在哺乳动物中调控超过60%的编码 RNA(能最终翻译成蛋白)。运些蛋白参与细胞活动的各个环节,如发育、增殖、命运决定、生 长控制、调亡w'w。由于miRNA靠5'端约7个核巧酸(称为种子区,seedregion)识别祀 mRNA的3'UTR,理论上一个miRNA可W与几百个mRNA结合;一个mRNA的3'UTR上也可W有 多个与miRNA种子区互补的序列。因此作为药物祀点,少量miRNA就可W在细胞的系统水 平(systemiclevel)上控制细胞的多个信号通路及活动。
[0005] 国内外的一些研究组已经开展miRNA与肿瘤的基础和应用研究,如miR-137在脑 胶质瘤中低表达,在胶质瘤细胞中过表达miR-137可W抑制细胞生长,降低细胞侵袭能力 能增强脑胶质瘤对卡莫司汀的耐药性化在多种肿瘤中过表达,抑制miR-1化可W有效地治疗乳腺癌的转移n°'2U;miR-124往往在胶质母细胞瘤中低表达,人为 过表达miR-124能降低胶质母细胞瘤的侵袭力^2'2气已有生物医学公司开始研发miR-lOb 的括抗剂用于胶质母细胞瘤的治疗。上述事实表明:l)miRNA做为药物治疗肿瘤有着切实 可行的应用基础和研究价值;2)miRNA已进入大医药公司的研发计划,开发新miRNA做为胶 质母细胞瘤的治疗药物具有良好的市场前景。

【发明内容】

[0006] 发明人在研究中发现在胶质瘤干细胞中,miR-874的表达显著低于其在正常神经 干细胞中的表达;在胶质母细胞瘤组织中,miR-874的表达显著低于其在正常脑组织中的 表达。miR-874在多种肿瘤中低表达,被认为是一种抑癌因子(tumorsuppressor),目前关 于miR-874的研究还没有将其应用于胶质瘤的治疗,因此可W根据miR-874的差异表达设 计针对胶质瘤干细胞和胶质瘤细胞的治疗研究,运对于治疗胶质母细胞瘤药物的研究具有 重要意义。
[0007] 针对现有技术,本发明对小分子RNAhsa-miR-874在GBM的调控作用及其用法进行 了研究,研究发现,其可作为抑制GBM细胞生长的调控分子,引起GBM细胞的调亡,抑制GBM 细胞的侵袭/转移,抑制GBM细胞中肿瘤干细胞的干性,从而可W用于制备治疗GBM的药 物、制备治疗GBM干细胞的药物、抑制GBM细胞生长的药物、抑制GBM侵袭/转移的药物。
[0008] 本发明第一个目的是请求保护小分子RNAhsa-miR-874在制备治疗胶质母细胞瘤 药物中的应用。
[0009] 本发明第二个目的是请求保护小分子RNA hsa-miR-874在制备治疗胶质母细胞瘤 干细胞药物中的应用。
[0010] 本发明第Ξ个目的是请求保护小分子RNA hsa-miR-874在制备抑制胶质母细胞瘤 细胞生长的药物中的应用。
[0011] 本发明所设及的的小分子RNAhsa-miR-874其核巧酸序列为:SEQ ID NO. 15' -cug cccuggcccg曰ggg曰ccg曰-3> ο
[001引制备上述药物的方法具体为:有效量的小分子RNAhsa-miR-874与一种或多种药 学上可接受的载体,制备抗胶质母细胞瘤药物。
[0013] 本发明利用qRT-PCR技术发现与正常神经干细胞相比,hsa-miR-874在GBM干细 胞中表达下调;同时,与正常脑组织相比,GBM肿瘤组织中hsa-miR-874表达也下调。
[0014] 本发明利用生物信息学方法确定了hsa-miR-874的祀基因为STAT3,并构建了 hsa-miR-874祀基因STAT3的报告载体,命名为psiCheck-STAT3。双巧光检测结果表明 STAT3的确是hsa-miR-874的祀基因。
[0015] 本发明体外转染hsa-miR-874,利用细胞生长曲线观察到miR-874可抑制GBM肿瘤 细胞及肿瘤干细胞的生长;利用化nnel染色法观察到miR-874可引起GBM肿瘤细胞及肿瘤 干细胞的调亡;利用细胞Boyden小室法可观察到miR-874抑制细胞迁移与侵袭;利用细胞 球形成可观察到miR-874抑制GBM干细胞的干性。
[0016] 本发明体外转染hsa-miR-874后,对祀基因进行RT-PCR和Wstern检测,其结果表 明,祀基因STAT3在mRNA和蛋白水平均表达下调。
[0017] 因此,本发明miR-874可能通过其祀基因STAT3参与了GBM干细胞与肿瘤细胞的 癌症发生发展过程,研究miR-874与GBM的关系意义重大。
[0018] 有益效果:
[0019] 本发明利用qRT-PCR技术发现与正常神经干细胞相比,hsa-miR-874在GBM干细 胞中表达下调;同时,与正常脑组织相比,GBM肿瘤组织中hsa-miR-874表达也下调,利用生 物信息学方法和双巧光检测确定了hsa-miR-874的祀基因为STAT3 ;miR-874可抑制肿瘤细 胞的生长,引起肿瘤细胞的调亡,并对肿瘤细胞的侵袭力,肿瘤干细胞的自我更新有抑制作 用,祀基因STAT3在mRNA和蛋白水平均表达下调;miR-874通过其祀基因STAT3参与了GBM的发生发展过程,它可作为GBM发生的调控分子,从而为临床治疗提供理论和实验依据。
【附图说明】
[0020]图1 :qRT-PCR检测hsa-miR-874在GBM干细胞和肿瘤细胞中的表达,其中,A: miR-874在神经干细胞(NSC)与GBM干细胞(GSC)中的表达差异,NSC和GSC分别使用3个 细胞系(linel-3)巧:miR-874在正常脑组织(Normal)与GBM病人脑组织(GBM)中的表达 差异;
[002。图2 :miR-874与其推测的祀基因STAT3的双巧光报告检测;
[0022]图3 :miR-874引起GBM干细胞的调亡;
[002引图4 :miR-874引起GBM细胞的调亡;
[0024]图5 :miR-874抑制GBM干细胞的生长;
[00巧]图6:祀基因STAT3表达差异的检测,其中,A :RT-PCR检测祀基因在mRNA水平上 的表达差异;B :Western检测祀基因在蛋白水平上的表达差异。
【具体实施方式】
[0026] 下面结合实施例对本发明做进一步说明,但不用于限制本发明的保护范围,下述 实施例中如无特殊说明,所采用的实验方法均为常规方法,所用材料、试剂等均可从生物或 化学公司购买。
[0027] 实施例1 :hsa-miR-874在GBM干细胞及GBM组织中表达水平的检测
[0028]Trizol法分别提取GBM干细胞和GBM组织细胞的总RNA。用PBS将细胞洗涂2遍, 每瓶加入Im口rizol,吹打混匀,室溫解育5min;将细胞液转移入DEPC处理过的1. 5ml离屯、 管中,每管加入0. 2ml氯仿,剧烈振荡15s混匀,冰上静置3~5min使分层;4°C,12000巧m, 离屯、15min;小屯、吸取上层液体,转移到另一个DEPC处理过的1. 5ml离屯、管中,加入等体积 已在4°C预冷的异丙醇,上下颠倒轻轻混匀15~30s,冰上(室溫)静置5~lOmin;4°C, 12000;rpm,离屯、15min;弃上清,加入1ml75%乙醇,轻轻洗涂沉淀2次;4°C,7500巧m离屯、 lOmin,弃上清,EP管倒置惊干,加入DEPC水30ul溶解RNA。紫外吸收测定法和琼脂糖凝胶 电泳检测总RNA的浓度和纯度。
[0029] 利用Invitrogen的逆转录试剂盒将上述所提总RNA进行cDNA的合成。反应体 系(20ul)如下:总RNA100pg-lug,5X逆转录反应缓冲液4ul,10XSuperSc;ript逆转录酶 化1,邸PC水补足到20ul。将上述体系混匀,PCR仪上进行逆转录,反应条件:42°C30min, 95°C5min,4°C保存。
[0030] 再W cDNA为模板,利用特异性hsa-miR-874TaqMan引物,在StepOne实时定 量PCR仪上进行Real-time PCR。反应体系(20ul)如下:20XTaqMan MicroRNA Assays lul,raqMan彩Universal Maste
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