一种rgd多肽靶向的锌掺杂的四氧化三铁纳米颗粒的制备方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种RGD多肽靶向的锌掺杂的四氧化三铁纳米颗粒的制备方法。该方法通过准确控制锌的掺杂量来提高Fe304 NPs的磁饱和值，并在其表面修饰肿瘤靶向肽RGD，最终得到了一种肿瘤靶向性的纳米复合磁性材料。本发明属于纳米生物医药材料领域。
【背景技术】
[0002]氧化铁纳米颗粒(1NPs)是一种极好的磁革El向性纳米材料，在制药学方面具有广泛的研究，比如提高药物协同效应在穿透血脑屏障(BBB)时的应用等等[23]。纳米技术的发展使得在磁场(外磁场或内置磁场)的帮助下，利用超顺磁纳米氧化铁(SP10N)作为药物载体系统可以使药物穿过血管系统定向性的到达肿瘤部位成为可能。比如，在2004年，为了检验磁靶向的阿霉素(Dox)到达肝癌细胞处的效果，实验于四个病人的三期临床已经开始执行[24]。除此之外，人血清白蛋白(HSA)包裹的1NPS (HINP)做为药物Dox的载体(D-HINPs)对患有乳腺癌的小鼠进行静脉注射，可以观察到Dox在HINP的帮助下可以穿透细胞膜甚至可以聚积在细胞核处，比单独的Dox具有更好的肿瘤抑制效果。除此之外，1996年，FDA已经批准1NPs可以作为人类肝和脾受损时做核磁共振成像(MRI)时的造影剂[18]。目前，有一些基于1NPs的造影剂(MR)已经或是正在应用于临床试验[19]。
[0003]为了保证在药物释放之前药物载体能正确到达靶位点，1NPs必须具有足够的磁力，这对磁力的有效利用非常有必要的。其中一种增大磁饱和值的方式就是掺杂二价金属元素，常用来掺杂的金属离子像Zn，Co, Ni, Cu和Μη等，这些掺杂的1NPs通常被简称为MxFe3 X04(x=0-1)。然而Zn掺杂的1NPs在生物医学应用上最为常见，原因之一就是Zn离子的毒性远比其他几种金属离子要小得多。
[0004]1NPs在这些生物医学方面的应用要求其具有较高的磁饱和值、较小颗粒尺寸(小于100nm)和较窄的颗粒尺寸分布。不仅如此，这些应用还需要1NPs具有特殊的表面包裹。因此这就需要包裹的表面活性剂具有无毒和优良的生物相容性。以前的研究表明二巯基丁二酸(DMSA)是无毒的，所以DMSA可以作为的表面活性剂来提高纳米颗粒的生物相容性(B1materials, 2010, 31(2): 366-74)。而且用DMSA进行双次水交换的1NPs表面带有羧基和巯基，这些基团能为纳米颗粒继续连接生物分子和其他反应。DMSA包裹的锌掺杂的四氧化三铁纳米颗粒(DMSA-Zn0.4Fe2.604 NPs)，由于具有高的磁饱和值，因此在外磁场的作用下，可以被用作调控细胞凋亡的信号途径的磁开关(Nature materials, 2012,11(12): 1038-43.)。初步的体外细胞实验表明DMSA-Zn0.4Fe2.604 NPs对健康细胞无毒性效应(Angewandte Chemie, 2009, 48(7): 1234-8)。对小鼠进行灌胃给药一个月以后，发现DMSA_Zna4Fe2.604 NPs也不会对小鼠产生明显的毒性效应。因此DMSA_Zna4Fe2.604 NPs可以作为纳米磁性材料应用与生物医学领域。
[0005]为了增加DMSA-Zn。.4Fe2.604 NPs对目标区域具有靶向性的准确度，还可以让DMSA-Zn。.4Fe2.604 NP s在外磁场的作用下可以结合一些蛋白质、药物、抗体、酶或是核苷酸，从而到达指定的组织器官或是肿瘤区。环状的精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸(cRGD)，通过结合细胞上过表达的整合素avb3，可以有效调控靶向到达微血管系统的肿瘤(如恶性胶质瘤)和癌细胞。很多R⑶靶向的磁性纳米材料在成像(B1materials，2009，30，6912 - 6919)(B1materials Science，2015，3, 721)、热疗(Journal of B1materials Applicat1ns，2014，28(7) 1051 - 1059)、药物载体运输(B1materials, 2011, 32，4151-4160)等领域已经得到广泛应用。但是为了增加磁性纳米材料的靶向性、生物相容性，因此，制备以DMSA-Zn。.4Fe2.604 NPs为介质，增加RGD为靶向抗体的新型造影剂或药物载体系统，具有较高的研究意义和应用价值。
【发明内容】
[0006]为克服现有技术的不足，本发明提供一种以DMSA-Zn。.4Fe2.604 NPs为介质，同时连接靶向分子的磁性纳米材料的制备方法。该方法利用简单经济的水热合成法得到高磁饱和值、粒径均一(约llnm)、单分性的Zna4Fe2.604 NPs，再进行两次水交换得到生物相容性好的、物理化学性能稳定的DMSA包裹的Z%4Fe2.604 NPs。最后通过连接c (RGDyK)从而得到双重靶向性的磁性纳米材料。所得的产物能满足临床应用的需求。
[0007]为实现这样的目的，在本发明的技术方案中，以一定比例的无机铁盐和无机锌盐为原料，在有机酸作为表面活性剂。同时以碱、醇类和水作为溶剂，在一定温度时反应若干个小时，即可制高磁饱和值、高结晶度的、颗粒均一的Zna4Fe2.604 NPs。进一步地，以DMSA作为表面活性剂进行两次水交换，即可得到稳定的水溶性纳米颗粒。最后，以1-乙基-3-(3- 二甲基氨丙基)_碳化二亚胺(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)为偶联剂，将不同含量的c (RGDyK)与DMSA-Zn。.4Fe2.604 NPs进行连接，即可得到具有高靶向性的磁性纳米材料。
[0008]—种RGD多肽靶向的锌掺杂的四氧化三铁纳米颗粒的制备方法，其特征在于，包括以下步骤:
(1)DMSA-Zn。.4Fe2.604 NPs 的制备:
首先把FeS04.(NH4)2S04.6Η20和ZnS04溶解在20ml的水里，使得前体达到1.73X10 3mol Fe2+ and 2.67X 10 4 mol Zn2+ 的目的；其次，把 10ml 油酸、10ml 水和 lg NaOH 混合，在常温下磁力搅拌直到得到均匀的溶液；再者，把前体Fe2+和Zn2+倒进该均匀溶液中，搅拌几分钟以后，混合溶液变成深棕色；最后把该溶液转移进50ml反应釜中，密封，230度加热15个小时；反应结束以后，冷却至室温，产品沉积在釜底，用环己烷溶解取出纳米颗粒；再把乙醇加入容有纳米颗粒的环己烷中，沉淀出纳米颗粒，最后纳米颗粒再用乙醇反复洗数次；颗粒表面的有机表面活性剂用二巯基丁二酸(DMSA)在60°C水浴机械搅拌12小时，重复两次交换，得到DMSA包裹的锌掺杂的超顺磁四氧化三铁纳米颗粒，该纳米颗粒能够彻底溶解在水相中；
(2)c (RGDyK) -DMSA- Zn0.4Fe2.604 NPs 的制备:
取EDC和NHS溶解在PBS缓冲液中(PH=7.4，0.05M)中，并用0.2M的盐酸调解PH。把上述溶解加入到一定量的DMSA-Zna4Fe2.604 NPs中，并超声10分钟，室温下反应；将混合物用PBS缓冲液(PH=7.4，0.01M)磁分离洗涤3次以除去多余的EDC和NHS，将活化后的DMSA-Zn0.4Fe2.604 NPs重新分散在PBS缓冲液中；把(:(RGDyK)溶解在PBS缓冲液中，并加入到以上活化后的DMSA-Zn。.4Fe2.604 NPs溶液中，室温反应；混合物用PBS缓冲液(PH=7.4，
0.01M)磁分离洗涤3次以除去多余的游离抗体，最后重悬于PBS(0.01M，pH 7.4)中，4°C保存。
[0009]所述的Zn掺杂的Fe304 NPs的量为0.4。
[0010]所述的ZnQ.4Fe2.604 NPs表面活性剂为进行两次交换的DMSA。
[0011]所述的盐酸调解PH为4-6。
[0012]所述的DMSA-Zn。.4Fe2.604 NPs的活化时间为2-24小时所述的c (RGDyK)与DMSA-Zn。.4Fe2.604 NPs的反应时间为3-24小时。
[0013]所述的DMSA-Zn。.4Fe2.604 NPs 与 c (RGDyK)的质量比值为 2-120。
[0014]本发明的优点在于:
(1)本发明以高磁饱和值的DMSA-Zn。.4Fe2.604 NPs介质，通过偶联的方法将靶向分子连接到其表面，从而得到肿瘤靶向性的纳米复合磁性材料。所用原料生物安全性高，经济简单。
[0015](2)本发明制备的磁性纳米材料具有良好的物理化学稳定性、靶向性和磁共振成像性能。
[0016](3)本发明中的制备方法工艺简单，可操作性强，能进一步满足生产和应用。
【附图说明】
[0017]图1为实施例各所制备的纳米颗粒的Zeta电势图。其中，随着加入的RGD量的增加，Zeta电势逐渐降低，这主要是因为连接上的RGD的天冬氨酸的负电荷所致。
[0018]图2为实施例1所制备的纳米颗粒的透射电子显微镜图。其中左图是DMSA-Zn。.4Fe2.604 NPs，右图是 RGD-DMSA_ZnQ.4Fe2.604 NPs。
【具体实施方式】
[0019]以下通过具体的实施例对本发明的技术方案作进一步描述。以下的实施例是对本发明的进一步说明，而不限制本发明的范围。
[0020]实施例1:
1.DMSA-Zn。.4Fe2.604 NPs 的制备
首先把FeS04.(NH4)2S04.6Η20和ZnS04溶解在20ml的水里，使得前体达到1.73X10 3mol Fe2+ and 2.67X 10 4 mol Zn2+ 的目的。其次，把 10ml 油酸、10ml 水和 lg NaOH混合，在常温下磁力搅拌直到得到均匀的溶液。再者，把前体Fe2+和Zn2+倒进该均匀溶液中，搅拌几分钟以后，混合溶液变成深棕色。最后把该溶液转移进50ml反应釜中，密封，230度加热15个小时。反应结束以后，冷却至室温。产品沉积在釜底，用环己烷溶解取出纳米颗粒。再把乙醇加入容有纳米颗粒的环己烷中，沉淀出纳米颗粒，最后纳米颗粒再用乙醇反复洗数次。颗粒表面的有机表面活性剂用DMSA进行双交换，使得纳米颗粒彻底溶解在水相中。
[0021]2.c (RGDyK)-DMSA- Zna4Fe2.604 NPs 的制备取EDC和NHS溶解在PBS缓冲液中(PH=7.4，0.05M)中，并用0.2M的盐酸调解P