一种纤维内外协同矿化胶原支架及其制备方法
【技术领域】
[0001]本发明属于组织工程支架材料领域，尤其是涉及一种纤维内外协同矿化胶原支架及其制备方法，特别是仿生矿化过程，涉及骨组织缺损修复材料的制备及应用。
【背景技术】
[0002]天然骨组织主要是由羟基磷灰石纳米晶体与I型胶原纤维有序排列组合形成的复杂的有机-无机复合体。由于肿瘤切除或外伤等因素所导致的骨组织缺损的修复一直以来都是科学研究及临床治疗的重点及难点问题。尽管自体骨骨移植技术已经在临床骨组织缺损治疗中取得了一定的成效，但其供给区对骨量的限制以及对患者所造成的二次伤害制约其进一步发展应用。近年来，随着组织工程的发展，越来越多的研究重心放在了如何制备一种具有良好生物相容性、适宜机械性能、一定骨诱导性及骨传导性的支架材料上。
[0003]鉴于I型胶原良好的生物学行为，使其成为支架基质材料的首选。但单独使用时，由于其机械性能较低、降解速率较快，无法很好的承担支架功能，因而对胶原支架如何进行仿生改性越来越多的受到关注。由于羟基磷灰石晶体较大，而自组装完成后的胶原纤维孔区直径较小，传统仿生矿化只能将无机物沉积在胶原纤维的外表面，形成外矿化。这种外矿化，虽然在一定程度上提高了支架的机械性能，降低了支架的降解速率，但与天然骨组织相比，并没有达到真正的仿生。
[0004]国内外大量研究表明，利用多聚物引导的液相前驱体(PILP过程)来矿化胶原纤维，可以达到胶原纤维内部矿化，形成与天然骨相似的纳米结构。但其使用的多聚物多为化学合成聚阴离子材料，应用于机体后的生物相容性有待研究，其次，其降解产物对机体是否有影响尚没有系统的探讨研究，因此寻找一种天然的具有良好生物学相容性的稳定材料显得十分必要。
【发明内容】
[0005]有鉴于此，本发明旨在提出一种纤维内外协同矿化胶原支架及其制备方法，以克服现有技术中的不足或缺陷，寻找到一种新型聚电解质多聚物，模拟骨组织发生过程，从而制备出基于仿生策略的纤维内外协同矿化胶原支架。
[0006]为达到上述目的，本发明的技术方案是这样实现的:
[0007]—种纤维内外协同矿化胶原支架，包括I型胶原纤维以及羧甲基壳聚糖，以I型胶原纤维为支架结构，并利用羧甲基壳聚糖使其实现内外协同矿化。
[0008]优选的，所述I性胶原纤维为I型鼠尾胶原。
[0009]本发明还提供了一种制备如上所述的纤维内外协同矿化胶原支架的方法，包括如下步骤，
[0010]1) I型胶原纤维的提取与自组装；
[0011]2)仿生矿化液的制备:将1?3mM的Κ2ΗΡ04在质量分数0.5?1.5%的羧甲基壳聚糖稳定下与3?5mM的CaCl2相混合，静置1?3小时；
[0012]3)纤维内外协同矿化胶原支架的制备:将步骤1)制备的胶原纤维从透析袋中取出，去离子水超声清洗后，置于羧甲基壳聚糖溶液中，30?45°C的条件下放置50?90小时；取出后用去离子水超声清洗，放入冷冻干燥机中冷冻干燥。
[0013]优选的，步骤1)中的I型胶原纤维的提取与自组装包括如下步骤，
[0014]A)将新鲜6?10周龄SD大鼠鼠尾浸泡于质量分数为65?85%乙醇溶液中10?20分钟;
[0015]B)取出后去除鼠尾皮肤，提取鼠尾腱，将提取的鼠尾腱置于Tris-HCl-NaCl缓冲溶液中，在1?7°C环境下浸泡20?28小时；
[0016]C)鼠尾腱取出后用去离子水冲洗，置于0.2?0.4M的醋酸溶液中，在室温下持续搅拌2?4天，得到胶原的醋酸溶液；
[0017]D)将步骤C)得到胶原的醋酸溶液在0?4°C，2000?4000r/min的条件下离心20?40分钟后取上清，放入透析袋中；
[0018]E)将透析袋置于0.015?0.025M的磷酸氢二钾溶液中透析5_7天，完成胶原的自组装过程。
[0019]优选的，所述步骤E)中，磷酸氢二钾溶液的浓度为0.02M。
[0020]优选的，所述步骤2)中，1(2即04的浓度为2mM，羧甲基壳聚糖的浓度为1 %，CaCl 2的浓度为4mM。
[0021]优选的，所述步骤3)中，胶原纤维置于羧甲基壳聚糖溶液后，在37 °C的条件下放置72小时。
[0022]本发明还提供了一种如上所述的纤维内外协同矿化胶原支架在骨组织修复中的应用。
[0023]本发明同时提供了如上所述的纤维内外协同矿化胶原支架的制备方法制备的胶原支架在骨组织修复中的应用。
[0024]相对于现有技术，本发明所述的一种纤维内外协同矿化胶原支架及其制备方法，具有以下优势:
[0025](1)较传统矿化方法，本发明更高程度的模拟出了骨发生过程，使得该矿化支架不仅在化学组成成分上具有与天然骨组织相似的成分，而且在微观结构上也具有类似的特征横纹结构(横纹直径D = 67nm)。
[0026](2)本发明所述的矿化胶原支架在湿润及干燥状态下机械性能和生物相容性(细胞的增值、成骨分化、动物实验)均较传统矿化支架优势明显。
[0027](3)本发明使用钙磷稳定剂为价格低廉、天然无毒副作用、具有良好生物学相容性、可以在体内生物降解且降解产物无毒副作用的羧甲基壳聚糖(CMC)。
【附图说明】
[0028]构成本发明的一部分的附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。在附图中:
[0029]图1为对比例1获得的未矿化胶原支架(NMC)、对比例2获得的传统矿化方法获得支架(BMC)、以及实施例1获得的矿化胶原支架(TMC)的实物图；其中左图为未矿化胶原支架(NMC)，中间为传统矿化方法获得支架(BMC)，右图为实施本发明方法获得的新型矿化支架(TMC) ο
[0030]图2中，a、b、c分别为NMC、TMC以及BMC的发射扫描电镜(SEM)的表征结果；d、e、f分别为NMC、TMC以及BMC支架材料的TEM表征结果；a中箭头所示为自组装完成的胶原纤维，b中箭头所示为矿物质沉积于纤维外部的传统矿化胶原纤维，c中箭头所示为仿生矿化得到的横纹(D = 67nm)明显的胶原纤维；d中箭头所示为NMC支架负染后可见特征性周期横纹，e中箭头所示为TMC支架矿物质沉积于纤维外部，f中箭头所示为未染色的BMC支架中形成的特征性周期横纹结构；
[0031 ] 图3为NMC、TMC以及BMC支架材料的X射线衍射(XRD)表征结果；箭头所示为羟基磷灰石特征峰值；
[0032]图4为干燥及湿润状态下NMC、TMC以及BMC支架材料三种不同支架材料弹性模量对比图；*号表示组间存在显著性差异P〈0.05 ;
[0033]图5为CCK-8检测及ALP检测3T3-E1细胞增殖及成骨分化结果；数据均采用单因素方差分析数据间的差异。
[0034]图6为Α0/ΕΒ染色后3T3-E1细胞分别在BMC、TMC、NMC支架上培养3天后激光共聚焦对比结果；a，b, c分别为BMC、TMC、NMC支架结果；
[0035]图7为大鼠头盖骨骨缺损模型的建立；
[0036]图8为4周、8周时骨缺损处Micro-CT扫描结果三维重建对比，a, b, c, d分别表示空白对照组、NMC支架组、TMC支架组、BMC支架组结果对比；
[0037]图9为4周、8周时缺损区组织切片HE染色结果；a，b, c, d分别表示空白对照组、NMC支架组、TMC支架组、BMC支架组结果对比；图中黑色箭头所指为新骨，白色箭头为缺损区头盖骨，白色五角星所指为未降解的材料。
[0038]图10为4周、8周时缺损区组织切片Masson染色结果；a, b, c, d分别表示空白对照组、NMC支架组、TMC支架组、BMC支架组结果对比。图中黑色箭头所指为新骨，白色箭头为缺损区头盖骨，白色五角星所指为未降解的材料。
【具体实施方式】
[0039]需要说明的是，在不冲突的情况下，本发明中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。
[0040]另外，在本发明的实施例中所提到的浓度单位M，是mol/L ；mM,是指0.001mol/L。
[0041]下面将参考附图并结合实施例来详细说明本发明。
[0042]实施例1
[0043]本发明所述的纤维内外协同矿化胶原支架，其制备包括如下步骤，
[0044](1) I型胶原的提取与自组装
[0045]将新鲜8周龄SD大鼠鼠尾浸泡于75%乙醇溶液中15分钟，取出后去除鼠尾皮肤，提取鼠尾腱，为防止胶原变性所有操作均在去离子水槽中进行。将提取的鼠尾腱置于Tris-HCl-NaCl缓冲溶液中(0.05mol/L, pH = 7.4)，在4°C环境下浸泡24小时。鼠尾腱取出后用去离子水冲洗，置于0.3M的醋酸溶液中，在室温下持续搅拌3天，得到胶原的醋酸溶液。将溶液在4°C，3000r/min的条件下离心30分钟后取上清，放入透析袋中。将透析袋置于0.02M的磷酸氢二钾溶液中透析5-7天，完成胶原的自组装过程。
[0046](2)仿生矿化液(CMC液)的制备
[0047]将质量分数为1 %的CMC加入2mM的1(2即04溶液中，然后逐滴加入4mM的CaCl 2相混合，静置2小时取上清。
[0048](3) BMC支架的制备
[0049]将(1)中制备而得的胶原从透析袋中取出，去离子水超声清洗后置于盛有(2)中制备而得的CMC矿化液的容器中，37°C的条件下放置24小时或72小时。取出后用去离子水超声清洗，放入冷冻干燥机中冷冻干燥，从而制备得出仿生矿化三维多孔胶原支架。
[0050](4)支架消毒将(3)中制备得的胶原支架在25kGy的剂量下进行Go60消毒。
[0051]对比例1
[0052]该对比例提供的是非矿化自组装胶原支架(NMC)的制备方法:
[0053](1) I型胶原的提取与自组装同实施例1中步骤⑴；
[0054]⑵NMC支架制备将⑴中制备而得的胶原从透析袋中取出，去离子水超声清洗后置于盛有去离子水的容器中，37°C的条件下放置72小时。取出后放入冷冻干燥机中冷冻干燥，从而制备得非矿化自组装胶原支架。
[0055](3)支架消毒方法同实施例1中步骤(4)
[0056]对比例2
[0057]该对比例提供的是