抑制肿瘤转移的IgE抗体的制作方法
【专利说明】抑制肿瘤转移的IgE抗体
[0001] 相关申请
[0002] 本申请要求2013年6月12日提交的美国临时申请No.61/834,169的权益，W及2013 年7月11日提交的美国专利申请No. 13/939，781的权益。W上申请的全部教导内容整体W引 用方式并入本文。
[0003] 政府支持
[0004] 本发明的作出得到了政府支持，具体为由美国国立卫生研究院（National InstitutesofHealth)资助的第CA111639号合同。政府在本发明中享有某些权利。
【背景技术】
[000引I姐抗体介导过敏和哮喘反应，运些反应的特征在于需要募集效应细胞的速发型 超敏和炎症延迟型应答。I巧抗体从外周循环转运到组织中，在那里它们可经由W下Ξ种类 型的化受体而结合过敏效应细胞，诸如肥大细胞、嗜碱性粒细胞、嗜酸性粒细胞、树突细胞、 朗格汉斯细胞、单核细胞和巨隧细胞:FceRK或高亲和力化eRKKa=l0iiM-i)、FceRII(或低 亲和力化eR，CD23KKa<l08M-i)和半乳凝素-3。不同于IgG类抗体，I巧W极高的亲和力结合 到其化R，该亲和力就化eRI而言比IgG对化R(Fc丫RI-III)的亲和力高大约Ξ个数量级，且 就FcεRII而言，与IgG对其高亲和力Fc丫RI的亲和力一样高（Gould，HJ，etal.， Annu.Rev.Immunol21:579-628.(2003);Gounni,AS,etalNature,367:183-186 (1994);Kinet,JP,Annu.Rev.Immunol.,17:931-72:931-972(1999)和RavetchJV,and KinetJP,Annu.Rev.Immunol.,9:457-492(1991))0
[0006]过敏肿瘤学(AllergoOncology)新出现的领域基于表明IgE介导的过敏与癌症之 间存在逆相关性的观察结果和研究（TurnerMC，etal.Jnt.J.Cancer,118 :3124-3132 (2006)；WangH&DiepgenTL,Allergy60:1098-1111,(2005)；TurnerMC,etal., Am.J.Epidemiol.,162:212-221(2005)；WangH,etal.,Int.J.Cancer,119:695-701 (2006)；MillsPK,etal.,Am.J.Epidemiol.,136:287-295(1992)；WiemelsJL,etal., (MincerRes.,64:8468-8473(2004);DodigS.,etal.,ActaPharm.,55:123-138(2005)和 WrenschM.,etal.,CancerRes.,66:4531-4541(2006))。因此，该领域的研究人员正在探 索I巧抗体类在W下前提下在预防和治疗某些癌症中的治疗潜力:最初作为对微生物/寄生 虫感染的适应性反应而发生的免疫反应在抗恶性肿瘤时可能是有用的。
[0007] IgE在癌症治疗方面的应用由Nagy等人倡导（Nagy，E.，etal.，Cancer Immunol.Immunother.，34:63-69(1991))，他们开发了对小鼠乳瘤病毒(MTV)的大囊膜糖 蛋白（gp36)具有特异性的鼠I姐单克隆抗体并证实了在具有同基因MMTV分泌性乳腺腺癌 (H27 12)的C3H/HeJ小鼠中的显著抗肿瘤活性（Nagy，E.，etal.，Cancer Immunol.Immunother. ,34:63-69 (1991))oKershaw等人(Kershaw,ΜΗ,etal. ,Oncol.Res., 10:133-142(1998))开发了名为30.6的鼠单克隆IgE,其为在结直肠腺癌细胞表面上表达的 抗原决定簇特异性的。小鼠I姐30.6抑制了在严重联合免疫缺陷（SCID)小鼠中的皮下生长 的既定人结直肠癌COLO205细胞的生长，但运种效应是短暂的。相比之下，小鼠IgG30.6未 显示出抗肿瘤效应。小鼠I巧的特定效果归因于该抗体与具有FceR的效应细胞之间的相互 作用，因为该活性具体地通过事先施用非特异性小鼠I扣而丧失化ershaw，MH，etal.， Oncol.Res.，10:133-142(1998))eGould等人开发了卵巢癌肿瘤相关抗原叶酸盐结合蛋白 (FBP)特异性的小鼠/人嵌合IgE(MOvlS-IgE)和IgGMOvlS(IgGl)。在人卵巢癌SCID小鼠异 种移植模型（IGR0V1)中对MOvlS-I巧和M0vl8-IgGl的保护活性进行了比较。MOvlS-I巧的有 益效果大于M0vl8-IgGl且持续时间更长，从而证实了I姐抗体优异的抗肿瘤效果(Gould, 町，etal.'Eur.J.Immunol.,29:3527-3537(1999))。
[0008]近来，Karagiannis等人证实了单核细胞通过两种不同的途径介导IgE依赖性肿瘤 细胞杀伤:ADCC(抗体依赖性细胞介导的细胞毒性)和ADCP(抗体依赖性细胞介导的吞隧作 用），运两种途径通过FceRI和FceRII介导（Karagiannis,SN,etalCancer Immunol.Immunother.,57:247-263(2008)和Karagiannis,SN,etal.,J.Immunol.,179: 2832-2843(2007))。该小组还使用运种测定系统证实了抗化巧可激活单核细胞而经由 ADCC在体外杀伤肿瘤细胞化arragiannisP.,etal.,(MincerImmunol.Immunother.,58: 915-930(2009) ,2008年10月22日在线出版）。另外的实例包括化等人(Clin.Exp.Immunol.， 153:401-409，2008)，他们证实了从膜腺癌患者分离的I姐类抗体介导对抗癌细胞的ADCC， W及Spillner等人(CancerImmunol.Immunother. ,61:1565-1573(2012)，他们展示了使用 单核细胞，在体外与抗EGFRIgG相比，抗EGFRI巧将对抗人上皮癌细胞系A431的细胞毒性 提高了高达95 %。
[0009]尽管在过敏肿瘤学的新兴领域中出现了鼓舞人屯、的发现，但是仍然迫切需要开发 治疗转移癌的新型治疗剂。
【发明内容】
[0010] 本发明提供了可用于抑制肿瘤生长和转移的新型I姐抗体。提供了具有对肿瘤相 关抗原(TAA)的结合特异性的包含人ε恒定区和可变区的治疗性单克隆I姐抗体。还提供了 对位于原发性实体瘤微环境中的至少一种宿主源非肿瘤细胞的活性重编程的方法，从而逆 转该非肿瘤细胞促进肿瘤生长和转移的能力。提供了治疗患者中的转移癌、抑制原发性肿 瘤发生转移和减缓原发性或转移性肿瘤的生长动力学的方法。
[0011] 在一个实施方案中，本发明提供了对位于患者实体瘤的微环境中的至少一种宿主 源非肿瘤细胞的活性重编程的方法，其中非肿瘤细胞介导肿瘤转移的能力受到抑制，该方 法包括施用肿瘤相关抗原特异性的I姐抗体的步骤，其中抗体在肿瘤的微环境内形成Ξ元 复合物，所述Ξ元复合物由I巧抗体、肿瘤相关抗原和肿瘤环境内源性的宿主源非肿瘤细胞 构成，其中抗体特异性结合到肿瘤相关抗原和位于宿主源非肿瘤细胞的表面上的抗体受 体，该抗体受体为I巧特异性的。
[0012] 在另一个实施方案中，本发明提供抑制患者中的实体瘤转移的方法，该方法包括 向患者施用能够在肿瘤的微环境内形成Ξ元复合物的I巧抗体，所述Ξ元复合物由肿瘤相 关抗原特异性的I巧抗体、肿瘤相关抗原和肿瘤微环境内源性的宿主源非肿瘤细胞构成，其 中抗体特异性结合到肿瘤相关抗原和位于宿主源非肿瘤细胞的表面上的抗体受体，该抗体 受体为I巧特异性的，并且其中在形成Ξ元复合物后，非肿瘤细胞介导肿瘤转移的能力受到 抑制。
【附图说明】
[0013]前述的W及其他的目标、特征和优点会从W下的本发明的优选的实施方案的更具 体的描述中更明显地表现出来，如附图所示，在不同的视图中，相似的字母对应相同的部 件。附图并不一定是按照比例制作的，而是在强调表现本发明的原理。
[0014]图1.嵌合I姐抗体的构造和抗原特异性。（A)载体构建体的图形表示。亲代载体为 pcDNA3.1/新霉素（pEpsilonI)、pEF6/灭攝素（pEpsilonII)、pcDNA3.1/博莱霉素 (pKappaI)和pcDNA3.1/潮霉素(pKappaII)。重链和轻链可变区基因从表1中的杂交瘤克 隆，并插入人ε或人k恒定区基因的上游。（B)SDS-PAGE分析。从转染的CH0-K1克隆纯化的嵌 合I姐W及得自骨髓瘤细胞系SK0-007的对照人I巧通过电泳在4-12%梯度丙締酷胺凝胶上 分离，并通过考马斯蓝染色。（C)抗体特异性分析。叠加柱状图示出了与未转染的细胞系相 比，结合到用同族抗原转染的细胞系的I姐的FACS分析。1巧.higE(抗hCD20)结合了用人 CD20cDNA转染的A20细胞，而3C6.hI巧(抗hMUC1，部分糖基化的形式)在用hMUC1cDNA转染的 小鼠乳腺癌细胞系4T-1上检测到人MUC1。折线图显示了通过4册.hi姐(抗hMUCl蛋白骨架） 对合成的hMUCl串联重复肤（50mer)的ELISA检测。对照肤源自hCD20的第二个胞外环 (43mer)。
[001引图2.肥大细胞和嗜酸性粒细胞介导的体外肿瘤细胞毒性。柱状图显示％PrCFSE+ 肿瘤细胞。将0CI-Ly8人B细胞淋己瘤细胞化CD20+)用l0-5mMCFSE标记15分钟。将lXl05个 标记的细胞与未染色的CBMC和2.扣g/mlI巧(A和B)或厮带血源性嗜酸性粒细胞(CBEo)和5 μg/mlI巧(C和D)混合，然后在37°C溫育2地。将细胞混合物用舰化丙晚(PI)染色，然后进行 流式细胞术分析。Pr细胞在CFSEhi组分中的百分比代表总肿瘤细胞毒性，并且结果W柱状 图形式示出。(A)在不同的效应细胞:祀细胞比率下CBMC和hi巧介导的肿瘤细胞毒性。（B)添 加化g/ml的封闭抗体或同种型对照化:Τ比率4:1)。（0在不同的效应细胞:祀细胞比率下 〔860和}11姐介导的肿瘤细胞毒性。（0)添加化旨/1111封闭抗体或101]/1111肝素。化:1'比率2.5: 1)。运里还显示了由单独的抗体诱导的肿瘤死亡的数据（即，在不存在效应细胞的情况下）。 显示的结果为一个代表性实验的平均值±SD。学生t检验*，ρ<0.05;**，ρ<0.01;***，ρ< 0.005。
[0016]图3.肿瘤特异性I巧抑制体内肿瘤生长。在第0天将105个4Τ1.hMUCl肿瘤细胞皮下 接种到hFceRI小鼠的两侦U。在第1、2、3、4和5天施用20yg对照或3C6.hIgE(抗hMUCl)。获取2 维卡尺测量值，直到肿瘤面积超过300mm2"(A)平均肿瘤大小对时间的曲线图。误差条表示 每个组的平均值±50。在最后的时间点每个组的存活小鼠/总小鼠数在括号中指出。抗 hMUCl组明显不同于对照组(双向4顯￥4，口<0.001)。（8和〇从(4)中所示的实验在第34天从 存活的小鼠收获肿瘤、切片并针对肥大细胞染色。肥大细胞在肿瘤的中屯、区W及在瘤周区 域中基本上不存在。存在的肥大细胞(红色箭头)未脱粒(B)。仅有来自3C6.hi巧处理组的小 鼠的一个肿瘤含有被肥大细胞浸润的区域，其显示了脱粒的证据(C)。
[0017]图4.}^1](：1特异性的小鼠1邑6介导。。61?1中的完全肿瘤排斥。将用人11](：1、抗hMUClI巧(3C6.mIgE)和/或细胞因子(MCP-1、比-5)转染的4T1肿瘤细胞的四种不同组合在 第0天皮下接种到hFceRITg+小鼠的两侧。每只小鼠总共施用1〇5个细胞(n= 4只/组）"(A)四 个实验组的说明。（B)实验被设计为测试I姐抗体与同族抗原(MUC1)和被所研究的两种细胞 因子吸引的髓样细胞的相互作用。将细胞混合，然后立即皮下注射到FceRIKO/Tg小鼠的两 侧（100，000个细胞/小鼠）。通过二维卡尺生长来监控肿瘤生长。除了第4组外，在每个组中 均观察到了渐进生长，在第4组中，肿瘤可暂时性触知，然后永久性消退。所示的数据代表两 个单独的实验。误差条表示平均肿瘤大小±SD。
[001引图S.hMUCl特异性的小鼠I巧介导化εΚΙKO/Tg小鼠中的完全肿瘤排斥。各个生长 曲线W及得自图6所示实验的重复实验的肿瘤测量平均值。将表达3C6.ml巧或细胞因子的 4T1肿瘤细胞如图6A中所示进行混合。数据得自各个肿瘤测量(A，C)或肿瘤体积的平均值 (B，D)。注意，在重复实验中，存在一组共4个表现出生长的肿瘤，尽管生长动力学大大降低。
[0019]图6.hMUCl特异性的小鼠I巧不能在野生型小鼠中介导完全的肿瘤排斥，但掲示出 预防转移的能力。将表达3C6.hi姐或细胞因子的各组4T1肿瘤细胞如图6A中所示进行混合， 并注入Ba化/c小鼠中。显示了各个肿瘤生长曲线(A，B)，和小组的平均值(C，D)。未在化εΚΙ KO/Tg小鼠中生长的第4组肿瘤在野生型小鼠中生长，尽管生长动力学大大降低。注意，第3 组肿瘤(单独的4Tl/hMUCl和细胞因子)表现出中等生长动力学。Ξ只化eRIKO/Tg转基因小 鼠包括在该实验中作为阳性对照，并且所有Ξ只在用第4组肿瘤注射时均未能展示出任何 肿瘤生长(D图，Π-Π)。第3组肿瘤(仅MUC1和细胞因子）降低的生长动力学可能源于W下 事实:运些小鼠在肿瘤发展过程的早期发生了转移，并且到第10天时开始体重减轻（图7)。 具有第4组肿瘤(3C6-mIgE+MUCl+细胞因子）的小鼠未显示出体重减轻或其他明显的转移迹 象，尽管在其两侧具有小的肿瘤。
[0020] 图7.第3和第4组小鼠中的体重减轻动力学。对用第3和第4组肿瘤注射的野生型小 鼠每5天进行称重，并计算平均值和标准偏差。注意，到第1