组织闭塞剂的制作方法
【专利说明】
[00011 本申请是中国专利申请200980139684.0的分案申请，原申请的申请日为2009年10 月06日，发明名称为组织闭塞剂。
技术领域
[0002] 本发明涉及一种组织闭塞剂，其特征在于，其含有自组装肽水凝胶。
【背景技术】
[0003] 用于防止生物体的组织损伤所产生的体液(血液、组织液等)漏出的组织闭塞在手 术等临床方面具有重要的意义。有效抑制损伤部的体液漏出关系到患者手术中的生命维 持、手术后的生活质量(QOL)的提尚。
[0004] 作为临床上止血被重视的原因，列举如下。
[0005] 1.失血是死亡的重要原因之一，失血的原因包括严重的外伤、动脉瘤、食道或胃中 的溃疡、以及食道静脉曲张的破裂等。特别是，在无法紧急接受止血治疗的情况下，死亡的 可能性升尚。
[0006] 2.手术时的出血是手术中重要的担心之一，出血会导致全身性感染症或器官功能 障碍。而且，出血不仅会妨碍手术视野，流出的血液的除去还会引起手术的延迟。
[0007] 3.即使在进行微创手术(腹腔镜手术等）的情况下，出血也是问题，还存在无法充 分抑制出血而不得不变更为外科手术(incisive surgery)的情况。
[0008] 作为现有的止血方法，列举如下。
[0009] 1.直接压迫出血部的血管的方法(压迫止血）。该止血法的缺点在于需要消耗时间 和劳力，需要预先维持压力，而且可能会使患者产生血肿。
[0010] 2.作为其他基于物理手段的止血方法，包括:夹紧、夹住出血部附近的方法;在出 血部放置塞子或海绵等物质的方法。这些止血法的缺点在于，在许多微血管均出血时操作 非常困难。
[0011] 3.利用热使血液凝固、对出血的血管进行烧灼的方法（电烙）。该方法的缺点在于 会使周围组织热损伤，对患者的侵袭（invasion)较大；需要医疗用器具，要求专业性(除医 疗机构以外不能使用）。
[0012] 作为现有的止血材料，列举如下。
[0013] 1.海藻酸
[0014] 2.明胶海绵
[0015] 3.胶原纤维
[0016] 4.纤维蛋白糊。
[0017] 上述材料中，胶原纤维和纤维蛋白糊作为有效的止血材料经常被用于临床中，但 它们的缺点可以列举如下：（1)明胶和胶原纤维是动物性胶原，纤维蛋白糊是使用了血液制 剂和来自于牛的凝血酶的动物来源的制品，因此存在引发感染的危险性；（2)由于非透明， 因而会妨碍手术。
[0018] 有时还有在手术中人为地使患者的血液凝固能力降低的肝素血状态。在使用人工 心肺的手术中，为了抑制血液凝固而使用肝素。对于生物体而言人工心肺装置是异物，若使 血液直接流入人工心肺装置，则血液会立即凝固，导致回路堵塞，因此要在进行体外循环之 前将肝素投与至血液中。
[0019] 胶原纤维、纤维蛋白糊是利用生物体的血液凝固系统进行止血，因此在肝素血状 态下，止血效果降低。若止血效果降低，则出血量增多，容易需要输血，而且体外循环终止后 的完全止血也需要较长时间。因此，需要一种即使在肝素血状态下性能也不降低的、不利用 血液凝固作用的止血材料。
[0020] 血管缝合不仅在心脏、血管系统手术中必要，在一般的腹腔内手术时也是必要的。 由于手术后血管缝合部有少量的血液漏出，因此需要一种能持续抑制血液漏出的止血材 料。
[0021] 胆汁痿、胰液痿是指由于胆管系统手术、胰腺炎或胰脏手术等而导致胆汁、胰液漏 出，从而对其他内脏器官造成不良影响的症状。目前，能够有效抑制胆汁或胰液的漏出、且 能够临床使用的物质尚且未知，需要一种安全且有效防止胆汁痿、胰液痿的方法。
[0022] 对于肺，已知由于肺泡囊肿破裂的自发性气胸、肋骨骨折或导管穿刺等外伤性气 胸等导致空气漏出的病状。根据症状的情况，有时只能等待自然治愈，作为治疗气胸的手 段，在患部仅将上层与肺组织粘着从而闭塞囊肿洞的方法被认为是简便且安全性高的方法 之一。
[0023] 由于内窥镜技术的发达，逐渐开发出在内窥镜下切除病变部位的技术。特别是已 经确立了利用内窥镜切除包括食道、胃或肠在内的消化道的息肉或早期癌症(认为未发生 淋巴结转移的浅表型癌症)等的病变部位的手术法。在内镜下粘膜剥离术中，通常向包含病 变部的粘膜下层注入高渗盐水等而使病变部隆起，一边抓住待切除部分一边利用电烙等切 除包含病变部的组织。
[0024] 在该技术中，为了使病变部与固有肌层分离而向粘膜下层注入高渗盐水等溶液， 但存在盐水等粘性低的溶液在手术中无法维持病变部的隆起的问题，需要一种在手术中能 够维持患部的隆起的注入液。
[0025] 另外虽然利用导管投与凝血酶等血管收缩剂从而抑制病变部切除部的出血这种 抑制出血的方法已被使用，但尚未确立能够完全阻止出血的有效的处置方法，同时还要求 一种能够迅速阻止切除后的出血的方法。
[0026] 由于导管疗法的发展，确立了以下手术方法:通过堵塞流入肿瘤或肌瘤等受血流 控制的病变部的动脉，从而使肿瘤或肌瘤等死灭。具体地说，可以举出肝动脉闭塞术、子宫 动脉闭塞术、脑动脉闭塞术等。
[0027]在该技术中，为了使动脉闭塞，需要注入从异种动物提取的胶原或乙烯-乙烯醇等 液体，但担心感染的危险性或生物毒性。因此，需要开发出一种不存在感染的危险性、且生 物毒性低的注入液。
[0028] 另外，还要求注入液中能够添加抗癌剂或造影剂。
[0029] 自组装肽具有以下特性:根据其氨基酸序列，形成许多肽分子有规则地排列的自 我缔合体。近年来，由于其物理、化学、生物性质，自组装肽作为新型材料受到关注。
[0030]自组装肽具有带电荷的亲水性氨基酸与电中性的疏水性氨基酸交替排列、正电荷 与负电荷交替分布的结构，在生理pH和盐浓度下为β结构。
[0031] 作为亲水性氨基酸，可以使用选自天冬氨酸、谷氨酸中的酸性氨基酸，和选自精氨 酸、赖氨酸、组氨酸、鸟氨酸中的碱性氨基酸。作为疏水性氨基酸，可以使用丙氨酸、缬氨酸、 亮氨酸、异亮氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸、丝氨酸、苏氨酸、甘氨酸。
[0032] 该肽的自组装在以下的条件下产生。
[0033] (1)肽分子在水溶液中采取结构，从而带有电荷的亲水性氨基酸和电中性的疏水 性氨基酸不均匀分布于肽分子的2面。
[0034] (2)在米取β结构时，与相邻分子形成互补的电分布。
[0035] (3)在采取结构时，与相邻分子形成充分的疏水键。
[0036] (4)通过1价的无机盐，氨基酸侧链的电荷被屏蔽。
[0037] (5)在肽的等电点附近，分子变为静电中性。
[0038]当上述条件齐备时，认为通过以下机制进行自组装。
[0039] (1)通过肽分子的交替分布的正电荷和负电荷，分子之间相互吸引而接近。
[0040] (2)在相邻分子的中性氨基酸侧链间形成疏水键。
[0041] (3)通过正负电分布，相邻分子之间的相对的配置被调整，分子间的缔合力增强。
[0042] (4)分子聚集体缓缓伸长，形成纳米纤维。
[0043]据报道，纳米纤维是粗IOnm~20nm左右的极细纤维，其以网状聚集，宏观上呈现凝 胶状。
[0044] 凝胶的网状结构在纤维尺寸和孔径等方面与天然的细胞外基质(ECM)非常类似， 其作为细胞培养的支撑物(scaffold)的利用正在被研究。
[0045] 该肽水凝胶具有生物降解性，分解产物不会对组织造成不良影响，生物体吸收性 高，因此适于细胞的植活、增殖。
[0046] 自组装肽为基于固相合成法的化学合成品，无需担心来自动物的感染症等，近年 来由于十分担忧疯牛病等来自动物的病毒或其他未知的感染症，因此其作为胶原等的替代 品进一步受到关注。
[0047] 专利文献1示出了自组装肽在止血中的应用，但在实施例中引用的论文的肝脏切 开部中的止血录像中，确认到血液从切开部末端持续性漏出，无法进行所报道的完全止血。 止血不完全的理由推测是由于自组装肽凝胶与组织的粘着不充分。因此，为了使自组装肽 的止血效果达到能够临床应用的水平，需要进一步的改良。
[0048] 专利文献1:国际公开第2006-116524号小册子
【发明内容】
[0049] 发明要解决的问题
[0050]本发明的目的在于提供一种自组装肽组织闭塞剂及其使用方法，该自组装肽组织 闭塞剂能够有效闭塞包括人在内的大型哺乳动物的组织的损伤部，且无需担心病毒等的感 染性。
[0051 ] 用于解决问题的方案
[0052]本发明人通过将用作细胞培养的支撑物的自组装肽水凝胶适用于组织闭塞中，发 现表现出与现有的组织闭塞剂同等或在其之上的组织闭塞效果，从而完成了本发明。另外 存在以下课题:单纯将肽水溶液适用于体液漏出部，无法获得充分的组织闭塞效果。因此， 深入研究的结果发现，通过从体液漏出部除去多余体液，能够得到充分的组织闭塞效果和 生物体安全性，由此完成了本发明。
[0053] 即，本发明涉及一种组织闭塞剂，其为含有肽的组织闭塞剂，该肽为亲水性氨基酸 和疏水性氨基酸交替结合的具有8~200个氨基酸残基的两亲性的肽，并且该肽为在生理pH 和/或阳离子的存在下在水溶液中显示为β结构的自组装肽。
[0054]在所述组织闭塞剂中，所述肽优选具有下述序列的重复序列：由精氨酸、丙氨酸、 天冬氨酸和丙氨酸组成的序列，由异亮氨酸、谷氨酸、异亮氨酸、和赖氨酸组成的序列，或由 赖氨酸、亮氨酸、天冬氨酸和亮氨酸组成的序列，更优选为由序列号1、序列号2、或序列号3 所述的氨基酸序列组成的自组装肽。
[0055] 为了防止溶血、炎症、感染症，所述组织闭塞剂优选进一步含有低分子药剂。
[0056] 所述低分子药剂优选选自由葡萄糖、白糖、精制白糖、乳糖、麦芽糖、海藻糖、葡聚 糖、碘、氯化溶菌酶、愈创蓝油经（dimethylisopropyIazuIene)、托可维A酸（tretinoin tocoferil)、聚乙稀啦略酮碘、前列地尔α-环糊精包合物(alprostadil alfadex)、茴香醇、 水杨酸异戊酯、α，α-二甲基苯乙醇、白檀醇(bacdanol)、新洋茉莉醛、磺胺啼啶银(sulfazin silver)、双丁酰环磷腺苷钠、前列地尔α-环糊精包合物、硫酸庆大霉素、盐酸四环素、夫西 地酸钠、莫匹罗星钙水合物和苯甲酸异戊酯组成的组。
[0057] 本发明还涉及一种添加抗凝固剂从而凝固能力降低的血液的出血止血剂;实质器 官的出血创面的止血剂;动脉性出血和静脉性出血的止血剂；防止胆汁从胆囊或胆管漏出 的制剂;防止肺部的出血或肺部的空气漏出的制剂；内镜下粘膜剥离术中能够以经导管的 方式适用的止血剂和用于注入粘膜组织而使切除部分隆起的注入剂;一种防止切除部分的 出血和体液漏出的制剂，所述切除部分为:将向粘膜组织注入液体而隆起的粘膜组织部分 切除的方法中的切除部分;或者动静脉闭塞术中的动静脉闭塞剂或静脉曲张硬化疗法中的 静脉曲张硬化剂，上述物质均含有上述组织闭塞剂。该动静脉闭塞剂或静脉曲张硬化剂中 还可以添加抗癌剂和/或造影剂。
[0058] 发明的效果
[0059] 本发明的组织闭塞剂，除