抗butyrophilin-3人源化抗体及其使用
【技术领域】
[0001]本发明属于医学生物技术和人源化抗体研究领域。本发明涉及对人butyrophilin-3 (嗜乳脂蛋_3)的抗原决定簇具有特异性识别的人源化抗体分子和包含所述抗体分子及其片段的组合物。本发明还涉及人源化抗butyrophilin-3抗体在治疗各种疾病中的用途。
【背景技术】
[0002]人的butyrophilin-3 (嗜乳脂蛋_3)基因家族位于6号染色体MHC I类分子基因簇的延伸端，最初称为MHC相关基因。Butyrophilin-3家族包含三个成员:BTN3A1，BTN3A2，BTN3A3。Butyrophilin-3基因在小鼠上缺失。Butyrophilin-3蛋白是单次穿膜蛋白，其胞外区结构属于免疫球蛋白超基因家族，包含有一个N端的IgV样结构域，和一个近膜端的IgC样结构域。BTN3A1，BTN3A2和BTN3A3的胞外区氨基酸组成上高度同源，其中IgV样结构域的同源性达99-100%。因此,针对IgV样结构域的抗butyrophilin-3抗体通常能同时识别BTN3A1，BTN3A2和BTN3A3，因此它是抗-BTN3A1人源化抗体、抗-BTN3A2人源化抗体和抗-BTN3A3人源化抗体的总称。
[0003]BTN3A1表达于人类各种肿瘤细胞膜表面，如非小细胞肺癌、肝细胞肝癌、胃癌、胰腺腺癌、乳腺癌、卵巢癌、宫颈癌、急性原髓样白血病、慢性髓样白血病、多发性骨髓瘤、红白血病、骨髓瘤细胞、滑膜肉瘤、软骨肉瘤等。
[0004]针对肿瘤细胞膜表面BTN3A1的抗体能够抑制肿瘤细胞的生长和诱导肿瘤细胞微管蛋白的解聚。因此开发一种人源化抗butyrophilin-3抗体能够有效地治疗多种肿瘤。
【发明内容】
[0005]本发明是基于所获得的一株具有与人butyrophilin-3蛋白特异性结合的亲本抗人butyrophilin-3鼠单克隆抗体6D9,通过克隆、鉴定与基因结构的分析,确定了其⑶R区序列，构建了相应的人源化抗体及其真核细胞表达载体，并获得了表达并分泌该抗人butyrophilin 3人源化抗体的细胞株,生产纯化了该人源化抗体。
[0006]本发明研发了针对butyrophilin-3蛋白IgV样结构域的人源化抗体，命名为Xylizumab (再力助单抗)，发现Xylizumab能够识别BTN3A1，BTN3A2和BTN3A3三个蛋白，其结合的表位位于butyrophilin 3蛋白IgV样结构域。
[0007]Xylizumab能够抑制20种人类肿瘤细胞系的生长，这些细胞系覆盖了上皮来源的癌症细胞如非小细胞肺癌细胞系(Calu-Ι)、肝细胞肝癌细胞系(Huh7，HepG2)、胃癌细胞系(MGC80-3)、胰腺腺癌细胞系(PANC-1, BxPC-3, CFPAC-1)、乳腺癌细胞系(SKBR3)、卵巢癌细胞系(SK0V3)、宫颈癌细胞系(HeLa);血液系统肿瘤，如急性原髓样白血病细胞系(HL-60, NB4)、慢性髓样白血病细胞系(K-562)、多发性骨髓瘤细胞系(U266，KM3)、红白血病细胞系(HEL);肉瘤，如骨髓瘤细胞系(U-2 OS, MNNG/H0S)、滑膜肉瘤细胞系(SW982)、软骨肉瘤细胞系(SW1353)。但它对正常细胞系HFLl没有表现出抑制作用。Xylizumab能够诱导某些肿瘤细胞凋亡，这种现象对于HL-60细胞特别明显，并且Xylizumab能够完全抑制HL-60的生长。
[0008]Xylizumab介导的肿瘤生长抑制是通过抗体与细胞膜上的BTN3A1结合后，来向胞内传递生长抑制信号的。Xylizumab在正常浓度10ug/ml的水平下就能发挥抑制效应，当培养体系中浓度增加至500ug/ml的时候,它能诱导细胞内微管蛋白解聚。
[0009]动物实验显示Xylizumab能够减缓移植性肝癌IfepG2和移植性骨肉瘤MNNG/HOS的生长，延长裸鼠的生存期。
[0010]另外，这个抗体能够抑制骨髓来源的原代急性髓性白血病M3和M4的细胞克隆形成，这说明该抗体能够治疗某些原代血液系统肿瘤。
[0011]由于BTN3A1广泛表达于几乎所有类型肿瘤细胞系中，所以BTN3A1能够做为不同类型肿瘤的共同革G标。Xylizumab能够通过与细胞膜上的BTN3A1结合来介导胞内微管解聚，这项功能的发现丰富了我们对抗体功能的认识，也拓展了抗体的应用范围。利用抗体的这一新功能，可以动态可逆地调节微管的聚合，并且以这个抗体为基础的免疫治疗也会具有广阔的应用前景。
[0012]因此，本发明主要涉及了以下几个方面:
第一方面，本发明涉及一种抗人butyrophi I in-3人源化抗体,其中所述人源化抗体由含有3个轻链可变区的轻链和含有3个重链可变区的重链组成，其中所述3个轻链可变区CDR 的氨基酸序列为 QSLSDN (SEQ ID NO:1)、FAS (SEQ ID NO:2)和 QQSHSWPYT (SEQ IDNO:3)，重链可变区 CDR 的氨基酸序列为 GFTFSSYA (SEQ ID NO:4)、I SSGGNYS (SEQ ID NO:5)和ARHGPDDFTSWVDY (SEQ ID NO:6)。本领域公知，抗体的结合特异性及亲合力均主要由CDR序列决定，根据成熟、公知的现有各项技术可轻易地将非CDR区域的氨基酸序列改变而获得具有相类似的生物活性的变体。本发明涉及的具有与上述CDR序列完全相同的CDR序列的单克隆抗体变体，因其具有与本发明所述的人源化抗体完全相同的CDR序列，因此具有相类似的生物活性。
[0013]第二方面,本发明涉及抗人butyrophilin-3人源化抗体的片段,其中该片段选自由F(ab’)2、Fab’、Fab、Fv、SCFv和抗体最小识别单位组成的组。并且该片段包含了 3个轻链可变区的⑶R和3个重链可变区的⑶R，其轻链可变区⑶R氨基酸序列为QSLSDN (SEQID NO:I) ,FAS(SEQ ID NO:2)和 QQSHSWPYT (SEQ ID NO:3)及重链可变区 CDR 序列为GFTFSSYA (SEQ ID NO:4)、I SSGGNYS (SEQ ID NO:5)和 ARHGPDDFTSWVDY (SEQ ID NO:6)。
[0014]第三方面，本发明涉及一种治疗疾病的方法，其中所述疾病选自由以下组成的组:肿瘤，如:骨肉瘤、软骨肉瘤、滑膜肉瘤、甲状腺髓样癌(MTC)、结肠直肠癌、肝细胞癌、肝癌、胃癌、食道癌、肺癌、非小细胞肺癌、乳腺癌、胰腺癌、卵巢癌、子宫癌、宫颈癌、子宫内膜癌、头颈部癌、膀胱癌、尿路上皮癌、前列腺癌、血液系统肿瘤、淋巴系统肿瘤、胸腺瘤、黑素瘤等；自身免疫性疾病，如:类风湿性关节炎、系统性红斑狼疮、多发性硬化症、系统性血管炎、自身免疫性肝病、天疱疮、硬皮病、皮肌炎、混合性结缔组织病、自身免疫性溶血性贫血、甲状腺自身免疫病、溃疡性结肠炎、Crohn氏病、银屑病、干燥性综合症、恶性贫血、新生儿溶血、自身免疫性溶血性贫血、特发性血小板减少性紫癜、胰岛素依赖型糖尿病、强直性脊柱炎、硬皮病、重症肌无力、结节性多动脉炎、Wegener肉芽肿病、亚急性细菌性心内膜炎等；免疫排斥性疾病，如宿主抗移植物反应、移植物抗宿主反应、输血相关性移植物抗宿主病、 过敏性反应等。
【附图说明】
图1a是采用ELISA方法证实抗-butyrophilin-3人源化抗体Xylizumab识别从CHO细胞表达纯化的BTN3A1、BTN3A2和BTN3A3。b是采用ELISA方法证实抗-butyrophi I in_3人源化抗体Xylizumab识别的抗原决定簇位于butyrophilin-3蛋白的Ig V结构域。由于butyrophilin-3蛋白的Ig V结构高度同源，因此Xylizumab能够同时识别BTN3A1、BTN3A2和 BTN3A3。
图2是Xylizumab抑制裸鼠移植性肝细胞肝癌IfepG2的生长。
图3是Xylizumab抑制裸鼠移植性骨肉瘤MNNG/H0S的生长。
图4是Xylizumab延长移植性肝细胞肝癌HepG2荷瘤裸鼠的生存期(log-rank test,Chi square=14.36, P<, 0.001)。
图5是Xylizumab延长移植性骨肉瘤MNNG/H0S荷瘤裸鼠的生存期(log-rank test,Chi square=12.67, P<, 0.001)。
【主权项】
1.一种组合物，其包括包含轻链可变区⑶R(互补决定区)序列QSLSDN (SEQ IDNO:1)、FAS(SEQ ID NO:2)和 QQSHSWPYT (SEQ ID NO:3)及重链可变区 CDR 序列GFTFSSYA(SEQ ID NO:4)、ISSGGNYS(SEQ ID NO:5)和ARHGPDDFTSWVDY (SEQ ID NO:6)的人源化抗-butyrophilin-3抗体、单链抗体或其抗体片段。2.根据权利要求1所述的组合物，其中所述抗butyrophilin-3人源化抗体包含人抗体IgGU IgG2、IgG3、IgG4、IgA、IgM、IgE、IgD任何其中之一恒定区的序列。3.根据权利要求1所述的组合物，其中所述组合物是药物组合物。4.根据权利要求1所述的组合物，其中所述抗体片段选自由F(ab’)2、Fab’、Fab、Fv、scFv和抗体最小识别单位组成的组。5.根据权利要求1所述的组合物，其中抗-butyrophilin-3人源化抗体或其片段是裸抗体或其片段。6.根据权利要求1所述的组合物，其中所述人源化抗-butyrophilin-3抗体与butyrophilin 3A1 (BTN3A1), butyrophilin 3A2 (BTN3A2), butyrophilin 3A3 (BTN3A3)彡口口。7.根据权利要求6所述,抗-butyrophilin-3人源化抗体是抗-BTN3A1人源化抗体、抗-BTN3A2人源化抗体和抗-BTN3A3人源化抗体的总称。8.根据权利要求1所述的组合物，其中所述抗-butyrophilin-3人源化抗体或其片段与至少一种诊断剂和/或治疗剂偶联以形成免疫偶联物。9.根据权利要求8所述的组合物，其中所述治疗剂选自由以下组成的组:裸抗体、细胞毒素剂、药物、放射性核素、硼原子、免疫调节剂、光敏性治疗剂、免疫偶联物、寡核苷酸和激素。10.根据权利要求9所述的组合物，其中所述细胞毒素剂是药物或毒素。11.根据权利要求10所述的组合物，其中所述药物具有选自由抗有丝分裂、烷基化、抗代谢、抗血管生成、细胞凋亡、生物碱、C0X-2抑制剂和抗生素剂组成的组的药物性质。12.根据权利要求10所述的组合物，其中所述药物选自由以下组成的组:氮芥、乙烯亚胺衍生物、烷基磺酸盐、亚硝基脲、三氮烯、叶酸类似物、蒽环霉素、紫杉烷、C0X-2抑制剂、嘧啶类似物、嘌呤类似物、抗代谢物、抗生素、酶、表鬼白毒素、钼配位络合物、长春花生物碱、经取代的脲、甲基肼衍生物、肾上腺皮质抑制剂、拮抗剂、内皮抑素、紫杉醇、喜树碱、奥沙利钼和阿霉素。13.根据权利要求10所述的组合物，其中所述药物选自由以下组成的组:5_氟尿嘧啶、aplidin、阿扎立平、阿那曲唑、蒽环霉素、苯达莫司汀、博来霉素、硼替佐米、苔藓抑素-1、白消安、刺孢霉素、喜树碱、卡钼、10-羟基喜树碱、亚硝脲氮芥、西乐葆、苯丁酸氮芥、顺钼(CDDP)、C0X-2抑制剂、伊立替(CPT-1l)、SN-38、卡钼、克拉屈滨、喜树碱、环磷酰胺