一种三维纳米纤维组织工程支架及制备方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及生物医学技术领域，具体而言，涉及一种三维纳米纤维组织工程支架及制备方法。
【背景技术】
[0002]基因治疗是一种通过载体将目的基因传递到靶细胞内进行适度表达或干扰以治疗疾病为目的的生物医学治疗方法。基因治疗三个基本要素组成:目的基因、基因运送载体及靶细胞。其中如何获得高效、无毒、可生物降解的基因运送载体，成为当前基因治疗领域的技术瓶颈。
[0003]目前应用于基因治疗的载体可分为病毒型基因载体和非病毒型基因载体两大类。病毒载体(如各种逆转录病毒、腺病毒、痘病毒、疱疹病毒、腺相关病毒等)在体内有较尚的转染效率，但存在着对外源基因的容纳量少(约4.5-30kbp)、稳定性差、勒向特异性差以及潜在的毒性和致癌性等缺点。非病毒载体包括脂质体和阳离子复合物，其优点是安全性好，基因装载容量大，但存在着转染效率低、靶向性差、有效表达时间短，容易被血液中的成分清除等缺点。
【发明内容】
[0004]本发明的目的在于提供一种三维纳米纤维组织工程支架，此三维纳米纤维组织工程支架不仅能够为细胞提供良好的类似于细胞外基质的生长微环境和足够的力学支撑，而且能够缓慢地自然降解并释放出携带有核酸的壳聚糖纳米微囊，壳聚糖纳米微囊又可以将其携带的核酸导入到细胞中，发挥局部靶向、时间可控的基因治疗作用。
[0005]本发明的另一目的在于提供一种三维纳米纤维组织工程支架的制备方法，以得到可用于基因治疗的三维纳米纤维组织工程支架，此三维纳米纤维组织工程支架不仅能够为细胞提供良好的类似于细胞外基质的生长微环境和足够的力学支撑，而且能够缓慢地自然降解并释放出携带有核酸的壳聚糖纳米微囊，壳聚糖纳米微囊又可以将其携带的核酸导入到细胞中，发挥局部靶向、时间可控的基因治疗作用。
[0006]本发明解决其技术问题是采用以下技术方案来实现的。
[0007]—种三维纳米纤维组织工程支架，其包括丝素蛋白-壳聚糖-核酸纳米纤维支架，该丝素蛋白-壳聚糖-核酸纳米纤维支架由含有壳聚糖-核酸纳米微囊和丝素蛋白的纺丝溶液经纺丝工艺制成的丝素蛋白-壳聚糖-核酸纳米纤维丝交联制成。
[0008]—种三维纳米纤维组织工程支架的制备方法，其包括:
[0009]制备壳聚糖-核酸纳米微囊；
[0010]配置丝素蛋白溶液；
[0011 ]将壳聚糖-核酸纳米微囊加入到丝素蛋白溶液中形成纺丝溶液；
[0012]采用纺丝工艺对纺丝溶液进行纺丝，制得丝素蛋白-壳聚糖-核酸纳米纤维丝；
[0013]交联丝素蛋白-壳聚糖-核酸纳米纤维丝，制得丝素蛋白-壳聚糖-核酸纳米纤维支架。
[0014]本发明提供的三维纳米纤维组织工程支架及制备方法的有益效果是:(1)由于三维纳米纤维组织工程支架的丝素蛋白-壳聚糖-核酸纳米纤维支架包被有用于基因治疗的核酸，治疗时，将三维纳米纤维组织工程支架放置于受损组织部位，改变了传统采用注射给药方式，其更具有靶向性。(2)此外，在三维纳米纤维组织工程支架降解的过程中，能够缓慢地自然降解并释放出携带有核酸的壳聚糖纳米微囊，壳聚糖纳米微囊又可以将其携带的核酸导入到细胞中，由于三维纳米纤维组织工程支架的降解过程比较缓慢，因此，核酸能够缓慢地且持续不断地从壳聚糖-核酸纳米纤维支架中转染进入到周围受损组织细胞中，这样使得核酸能够对受损组织中发挥功能的时间更具有持续性也更稳定，表现出时间可控的基因治疗效果，其克服了现有的基因载体其携带的基因在转染受损组织细胞中的表达瞬时性的缺点。(3)还有，本三维纳米纤维组织工程支架采用丝素蛋白和壳聚糖制备而成，仿生天然细胞外基质的，其具有更好地生物相容性、极高的比表面积、高孔隙率和相互连通的三维网络状结构，非常有利于细胞粘附和迀移，为细胞提供了良好的生长微环境。
【附图说明】
[0015]为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。
[0016]图1为本发明实施例的壳聚糖-核酸纳米微囊在原子力显微镜下的形态图(图中箭头指示其中一个壳聚糖-核酸纳米微囊，A、B为不同放大倍数下的形态图)；
[0017]图2为本发明实施例的丝素蛋白-壳聚糖-核酸纳米微囊和三维纳米纤维组织工程支架的凝胶电泳检测图(ASDNA 1^4虹、8为纯质粒？6?1]6/6??/如0、(:为壳聚糖-核酸(pGPU6/GFP/Neo)纳米微囊、D为三维纳米纤维组织工程支架)；
[0018]图3为本发明实施例的三维纳米纤维组织工程支架在扫描电镜(S3700，3.0OkV，
11.4_X3.00k)下的形态图(黑色箭头指示三维纳米纤维组织工程支架孔隙中充注的胶原；白色箭头指示包裹在三维纳米纤维组织工程支架纤维上的胶原)；
[0019]图4为本发明实施例的三维纳米纤维组织工程支架将携带的pGPU6/GFP/Neo转染至IJ细胞后表达的绿色荧光蛋白检测图(图中A1、A2、A3和A4分别代表生长在三维纳米纤维组织工程支架上的细胞在第7天、14天、21天和28天时细胞内绿色荧光蛋白检测图；B1、B2、B3和B4分别代表使用Lipofectamine 2000转染pGPU6/GFP/Neo质粒后的细胞在第3天、7天、14天和21天时细胞内绿色荧光蛋白检测图；图中箭头指示其中一个表达绿色荧光蛋白的细胞)；
[0020]图5为本发明实施例的三维纳米纤维组织工程支架对细胞增殖能力影响的OD值检测图(图中表示差异显著p〈0.05)。
【具体实施方式】
[0021]为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品O
[0022]下面对本发明实施例的三维纳米纤维组织工程支架和三维纳米纤维组织工程支架的制备方法进行具体说明。
[0023]三维纳米纤维组织工程支架其包括丝素蛋白-壳聚糖-核酸纳米纤维支架，该丝素蛋白-壳聚糖-核酸纳米纤维支架由含有壳聚糖-核酸纳米微囊和丝素蛋白的纺丝溶液经纺丝工艺制成的丝素蛋白-壳聚糖-核酸纳米纤维丝交联制成。
[0024]其中，壳聚糖-核酸纳米微囊中的核酸可以是能携带功能基因的质粒例如pGPU6/GFP/Neo、pEGFP-N2、pCMVp-NE0-BAN、pYrb1-LT-l、supersilencing? shRNA、OmicsLink?shRNA等;此外，核酸还可以是siRNA或反义寡核苷酸片段等。
[0025]其中，壳聚糖-核酸纳米微囊中的壳聚糖(chitosan、CS)的分子量范围为50KDa?190KDa，脱乙酰度为75?85%。
[0026]作为优选，该三维纳米纤维组织工程支架包括有胶原包覆层，胶原包覆层包覆丝素蛋白-壳聚糖-核酸纳米纤维支架。
[0027]三维纳米纤维组织工程支架的制备方法包括:
[0028]SI制备壳聚糖-核酸纳米微囊
[0029]具体地，先将壳聚糖和核酸分别溶于乙酸钠缓冲溶液中，乙酸钠溶液的pH为5.4?5.6，制得0.16?0.24mg/mL壳聚糖溶液和0.08?0.12mg/mL的核酸溶液，再将壳聚糖溶液与核酸溶液分别加热到50?55°C，再将壳聚糖溶液与核酸溶液混合，在漩涡振荡器上在2400?2600rpm的转速下振荡混匀25?40s，然后室温静置30?60min，得到含有壳聚糖-核酸纳米微囊的壳聚糖-核酸纳米微囊溶液。作为优选，控制得到的壳聚糖-核酸纳米微囊溶液中壳聚糖与核酸的质量比为1.8?2.2:1。优选地，壳聚糖与核酸的质量比为2:1，使得形成的壳聚糖-核酸纳米微囊大小均一，其粒径绝大多数分布在20?25nm的纳米级别，更易于细胞吸附，有助于提高转染效率。
[0030]其中，壳聚糖作为天然生物材料，除了具有抗菌消炎作用外，还可包裹核酸形成壳聚糖-核酸纳米微囊，核酸通过壳聚糖的包裹能偶避免核酸在转染到细胞中之前被核酸酶等降解。另外，壳聚糖-核酸纳米微囊的粒径大小适于细胞吞噬，且其表面易于与细胞膜吸附，保证了核酸能够顺利转染到细胞中。
[0031]其中，丝素蛋白作为天然生物材料，具有较强的力学性能和较好的生物相容性。
[0032]其中，核酸可以是能携带功能基因的质粒，质粒又可以是过表达载体例如pGPU6/GFP/Neo、PEGFP-N2、pCMVp-NE0-BAN或者抑制载体例如pYrbi O-LT-1、supersilencingTMshRNA、OmicsLink? shRNA