miRNA-9在制备抑制肿瘤转移药物中的应用
【技术领域】
[0001] 本发明设及miRNA-9在制备抑制肝癌转移药物中的应用，属于生物化学与分子生 物学技术领域。
【背景技术】
[0002] 根据世界卫生组织2014年发布的癌症白皮书，肝癌在我国无论男性或者女性的发 病率和致死率都极高，严重地影响了人类的生存和健康。恶性肿瘤细胞与普通肿瘤细胞的 区别是前者具有转移能力，其转移能力越高，恶性程度也就越高，越难W治愈。肿瘤的转移 机制是一个复杂的网络通路，近年来，随着人们对miRNAs的研究发现，有些miRNAs参与调控 肿瘤的发生和发展过程，可W将其作为早期诊断或者早期治疗的分子祀标。
[0003] 随着糖科学的迅速发展，有关肿瘤与糖基化修饰之间的关系已经越来越多的被科 学家证实。唾液酸转移酶属于脊椎动物唾液酸转移酶家族，该家族包括a-2，3，a-2，6，a-2，8 唾液酸转移酶3个亚型。其中a-2,6唾液酸转移酶表达在机体许多种细胞的表面，可催化活 化的唾液酸Wa-2,6糖巧键的形式连接到细胞膜表面的N-乙酷乳糖胺上。唾液酸作为复合 糖的组成部分镶嵌于所有细胞表面W及大多数脊椎动物糖蛋白和糖脂分子的末端最外侧。 唾液酸介导或调制了炎症、病原感染、肿瘤发生发展等诸多病理过程，与人类疾病密切关 联与正常组织相比较发现，恶性肿瘤组织和恶性肿瘤细胞表面糖链结构发生明显变 化。其中，特征连接唾液酸表达的显著上调或下调变化与恶性肿瘤的发生、发展、侵袭、转移 和预后不良等相关，有的作为肿瘤标记物或预后标记物，也可能成为肿瘤免疫治疗的祀 占[4] O
[0004] miRNAs是真核生物中一类内源性的具有调控功能的非编码RNA，长约20~25个核 巧酸。成熟的miRNAs是由较长的初级转录物经过一系列核酸酶的剪切加工而产生的，通过 碱基互补配对的方式识别祀mRNA，并根据互补程度的不同指导沉默复合体降解祀mRNA或者 阻遏祀mRNA的翻译。自从1993年，Lee等科学家利用遗传分析的方法在秀丽隐杆线虫中发现 了miRNA后，科学家开展了大量关于miRNA相关功能的研究。目前已有很多miRNA被鉴定参与 细胞癌变、转移等病理过程。如:miR21、miR122、miR182、miR34a、miR138、Let-7c等分别参 与乳腺癌、膀脫癌、肺癌、脑胶质瘤等恶性肿瘤的发生和转移过哲SHW。其中，有关miRNA参 与调控糖基化修饰的研究也有相关报道。例如，let-7c通过调控甘露糖乙酷基转移酶4的合 成(该酶参与了细胞表面糖基化的修饰过程)抑制了小鼠肝癌细胞的转移W来自秀丽线虫 中的miR-79与其在哺乳动物中同源的miRNA-9通过调控细胞糖基化修饰过程，影响参与哺 乳动物神经元转移的两个祀基因 SQV-5和SQV-7的合成W。然而，关于miRNA-9在小鼠肝癌转 移中的作用机制还未有报道，包括其祀基因的研究也仅限于少数基因。
【发明内容】
[000引针对上述现有技术，本发明提供了 miRNA-9在制备抑制肿瘤转移药物中的应用。
[0006]本发明是通过W下技术方案实现的：
[0007] 本发明的数据基础建立在小鼠肝癌细胞中microRNA差异表达忍片之上，根据忍片 结果，筛选出在小鼠普通肝癌细胞化epal-6)、低转移能力的小鼠肝癌细胞化ca-P)和高转 移能力的小鼠肝癌细胞化ca-F)中存在显著表达差异的miRNAs作为候选miRNA，利用RT-qPCR验证忍片结果，找到在S种细胞中存在显著差异的miRNA-9作为研究的基础。接下来， 利用western blotting实验方法发现StGgall在S种细胞中的表达量同样存在显著差异， 并与miNRA-9在=种细胞中的表达差异吻合。为了验证Stegall是miRNA-9的祀基因之一，设 计实验构建了双巧光素酶报告基因，并将miRNA-9的模拟物:miRNA-9 mimic与报告基因共 转染至化pal-6中，通过检测，证实了Stegall为miRNA-9的祀基因。最后，将miRNA-9的模拟 物和抑制物:miRNA-9 mimic、miRNA-9 inh化itor分别转染到上述S种细胞中，发现miRNA-9的mimic可W抑制Stegall在S种细胞中的表达量。同时，miRNA-9在细胞中的过表达可W 抑制其增殖、迁移、侵袭和黏附能力。因此，miRNA-9具有抑制小鼠肿瘤细胞的转移能力，可 W应用于抑制肿瘤转移药物的开发领域。
[0008] 具体地，本发明提供一种miRNA-9在制备抑制肿瘤转移药物的应用，所述miRNA-9 的序列如SEQ ID NO. 1所示。
[0009] 本发明还提供miRNA-9的模拟物在制备抑制肿瘤转移药物的应用，所述miRNA-9 模拟物的的正义链序列如SEQ ID NO.2所示，反义链序列如SEQ ID NO.3所示。
[0010] 在优选的技术方案中，所述miRNA-9或miRNA-9模拟物用于制备抑制肝癌转移药 物。
[0011] 本发明还提供miRNA-9的祀基因，该祀基因为Stegall。
[001引在本发明所述miRNA-9可W用于制备抑制肝癌等转移性肿瘤转移的药物。具体应 用时，可W将miRNA-9的模拟物用于药物设计，也可W构建miRNA-9的真核表达载体，用于基 因治疗。
【附图说明】
[0013] 图1表示miRNA-9在Hca-F, Hca-P和Hepal-eS种小鼠肝癌细胞中的相对表达量的 real-time PCR结果；
[0014] 图2表示StSgal 1蛋白在化a-F，化a-P和化pal -6S种小鼠肝癌细胞中的表达量的 Western Blotting实验结果；
[001引图3表示Stegal 13 ' UTR区域中与miNRA-9结合位点；
[0016] 图4表示双巧光素酶报告基因检测系统分析miR-9的mimic对St6gal-3'UTR/p化-3 巧光强度的影响；
[0017] 图5表示转染miRNA-9的mimic、mimic NC、inhibito;r、inhibitor NC后StGgall蛋 白在化a-F，Hca-P和化pal-6S种小鼠肝癌细胞中的表达量；
[0018] 图 6 表示 miRNA-9 的模拟物mimic 和抑制物 inhibitor 在Hca-F, Hca-P 和H邱 al-6S 种小鼠肝癌细胞的转染效率；
[0019] 图7表示S种细胞分别转染miRNA-9的mimic、mimic NC、inhibito;r、inhibitor NC 后细胞增殖能力的变化；
[0020] 图 8表示Hca-F ,Hca-P和 Hepal-GS种小鼠肝癌分别转染 miRNA-9 的mimic、mimi C NCJnhibitor,inhibitor NC后细胞迁移能力的变化；
[0021 ]图 9表示Hca-F，Hca-P和Hepal-6S种小鼠肝癌分别转染miRNA-9的mimic、mimic NCJnhibitor,inhibitor NC后细胞侵袭能力的变化；
[002引图10表示不同包被浓度下化a-F和化a-P细胞与FN、LN、C0L的黏附能力显著高于 胎pal-6细胞；
[0023] 图 11 表示Hca-F,Hca-P和Hepal-GS种小鼠肝癌分别转染miRNA-9的 mimic、mimic NC、inhibitor、inhibitor NC后p-FAK蛋白水平表达量。
【具体实施方式】
[0024] 下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，运些实例仅用于说明本发明而 不用于限制本发明的应用范围。下面实施例中未注明具体实验条件的方法，通常按照常规 条件或分子克隆中所述条件，或按照产品说明书上所提供的条件。下面实施例中所用的材 料、试剂等如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[0025] 本发明的数据基础建立在小鼠肝癌细胞中microRNA差异表达忍片之上，根据忍片 结果，筛选出在小鼠普通肝癌细胞化epal-6)、低转移能力的小鼠肝癌细胞化ca-P)和高转 移能力的小鼠肝癌细胞化ca-F)中存在显著表达差异的miRNAs作为候选miRNA，根据忍片结 果的分析，确定候选的HiiRNA为miRNA-9，其序列为UCUUUGGUUAUCUAGCUGUAUGA。
[0026 ]本发明使用的细胞、试剂盒W及试剂：
[0027] 所述肝癌细胞化pal-6为小鼠普通肝癌细胞、所述肝癌细胞化a-P为低转移能力的 小鼠肝癌细胞、所述肝癌细胞化a-F为高转移能力的小鼠肝癌细胞，根据文献(Y.Guo et al.The International Journal of Biochemi stry&Ce 11 Biology, 2014,53,1 ~8)获得。 pG13载体购自（Promega，USA)，pMD-19T载体购自（TaKaRa，Japan)。
[0028] miRNA-9的模拟物、抑制物W及相应阴性对照物的名称和序列如表1。
[0029] 表l.miRNA-9、miRNA-9的模拟物、抑制物W及相应阴性对照物的名称和序列
[0032] 实施例1
[0033] miRNA-9在不同小鼠肝癌细胞中的表达:将对数期的小鼠肝癌细胞化pal-6、化a-P、Hca-F分别贴壁和悬浮培养在含有90%DMEM、90%RPMI1640和10%FBS的全培培养基中， 在37°C、5%C02的培养条件下培养24h，得到状态良好的小鼠肝癌细胞。收集细胞，通过 Tr i SO1法提取细胞中的总RNA。将提取的总RNA反转录得到CDNA，RNA模板的含量为化g总 RNA。将反转得到的CDNA根据进行real-time PCR检测miRNA-9在S种细胞中的表达量，根据 试剂盒(Bulge-LoopTViRNA qRT-PCR，RIB0BI0)的说明进行，通过PCR反应扩增扩增mi