PBS洗涂细胞3次（10(K)rpm离屯、 5min)，调整细胞密度至5 X IO4个/ml，吸取约10化1不含FBS的培养基将各组细胞悬液按每 孔10化1的量加入化answe 11小室中，每组细胞设3个复孔。在24孔板的下室内分别加入60化 1全培养基，37°C，5 % C〇2培养箱中培养细胞2地。PBS冲洗各小室3次，用棉签擦拭上室的上 层细胞(未穿过小室的细胞）。另取24孔板，在每孔中加入约20化1 4%的多聚甲醒，将小室 置于其中，使膜浸没在多聚甲醒中，固定15min后，取出化answell小室，用PBS冲洗S次，冲 洗小室下部未固定的细胞。接下来，待膜风干后将小室浸在含0.1 %结晶紫溶液的24孔板 中，染色15min"PBS小屯、洗膜3次，至小室上多余的结晶紫染色洗去。正置显微镜观察 Transwell小室下底面发生转移的细胞，并对转移的细胞进行计数，各组细胞间的差异采用 单因素方差分析，SPSS13.0统计学软件进行分析，结果如图8所示，其中图8A-C分别为对 Hepal-6、Hca-P、Hca-F的实验结果。图8中可见，转染miRNA-9的mimic,相对于转染了 miRNA-9的inhibitor, S种细胞的转移能力明显被抑制，而加入inhibitor时S种细胞的转移能力 都显著高于未处理的=种细胞，说明miRNA-9可W抑制小鼠肝癌细胞的转移能力。
[0070] 4.对细胞侵袭能力的影响
[0071 ] Transwell 小室检测转染 miRNA-9 的mimic 和inhibitor 后 Heapl-6 ,Hca-P 和 Hca-F S种细胞侵袭能力的变化:将BD胶置于4°C过夜融化，待胶融化后，将BD胶分别与无血清的 DM抓、RPMI1640培养基按1:10的比例混匀，加入混合液10化1于各个小室中。将小室置于在 37°C、5 % C〇2培养箱中解育30min。吸出胶融化后小室中残余的空培养基，加入转染好的各 组细胞于小室中，细胞数量约5 X 1〇4个/ml。其余步骤同化answell小室实验检测细胞的迁 移能力。此实验需要注意铺胶前需要全程保证冰上操作，避免超过l〇°C。结果如图9所示，其 中图9A-C分别为对H邱al-6、Hca-P、Hca-F的实验结果。图9中可见，转染miRNA-9的mimic后 穿过小室的细胞数量显著低于转染了miRNA-9的inhibitor的细胞数量。说明miRNA-9可W 抑制小鼠肝癌的侵袭能力，相反的，mi RNA-9的inhi b i tor可W提高小鼠肝癌细胞的侵袭能 力。
[0072] 5.对细胞黏附能力的影响
[0073] W小鼠肝癌化a-F，化a-P和化pa 1-6细胞为研究对象，观察两种细胞与主要细胞外 基质成分FN(纤连蛋白）、LN(层粘连蛋白）、C0L(胶原蛋白）黏附能力的差异。不同浓度(5nM 和IOnM)的FN、LN、C0L分别包被96孔板，4°C包被过夜，其中牛血清白蛋白（BSA)及多聚赖氨 酸(P-LYS)的包被分别作为阴性和阳性对照。使用含0.1 % BSA的无血清培养基悬浮细胞，并 种植于包被好的96-we 11板中，37°C解育1小时。冷PBS洗掉未结合的细胞，使用40 %甲醇配 审揃0.3%结晶紫标记结合细胞，染色持续30min，d地2〇清洗后，570nm波长下检测结果。每 个处理需要S个复孔。结果如图10所示：在不同包被浓度下，Hca-F和化a-P细胞与FN、LN、 COL的黏附能力显著高于化pal-6细胞。
[0074]由图7-9的实验结果可推断miRNA-9可W抑制小鼠肝癌细胞的转移能力。
[007引 实施例5
[0076] 为了找到miRNA-9对细胞黏附功能改变的信号通路，在实施例4中所述的miRNA-9 对小鼠肝癌Hca-F，Hca-P和H邱al -6细胞肝癌Hca-F，Hca-P和H邱al-6细胞实验结果的基础 上，设计实验如下所示：
[0077] 小鼠肝癌Hca-F ,Hca-P和Hepal-6细胞分别用miRNA-9的mimic、mimiC NC、 inhibitor、inhibitor NC转染后，培养24小时，用于如下试验。
[0078] 免疫印迹分析蛋白憐酸化水平
[0079] 。W IQnM的FN包被细胞培养板，4°C包被过夜；
[0080] 2)使用含0.1%BSA的无血清培养基悬浮各转染细胞和未转染细胞(mock)，并种植 于包被好的细胞培养板中，37°C解育1小时；
[0081 ] 3)冷PBS洗掉未结合的细胞后细胞裂解液充分裂解结合细胞，BCA蛋白定量后进行 Western blot检测；
[0082] 4)其中利用FAK抗体检测FAK的总蛋白水平，P-FAK抗体检测其憐酸化水平。
[0083] 得到的结果如图11所示，其中图IlA-C分别为对化pal-6、化a-P、化a-F的实验结果 可见，转染了miRNA-9的mimic的S种细胞的P-FAK蛋白水平表达量下降，显著低于转染了 miNRA-9的inhibitor的细胞，说明miRNA-9是通过抑制FAK蛋白憐酸化水平来降低细胞的黏 附能力。
[0084] 参考文献；
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【主权项】
1. miRNA-9在制备抑制肿瘤转移药物中的应用，所述miRNA-9的序列如SEQ ID N0.1所 不。 2. miRNA-9的模拟物在制备抑制肿瘤转移药物中的应用，所述miRNA-9模拟物的的正义 链序列如SEQ ID NO.2所示，反义链序列如SEQ ID NO.3所示。3. 根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述肿瘤为肝癌。4. 根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述肿瘤为肝癌。 5.St6gall在制备抑制肝癌转移药物中的应用，其特征在于，所述St6gall为如权利要 求1所述的miRNA-9的靶基因。
【专利摘要】本发明公开了miRNA-9在制备抑制肿瘤转移药物中的应用，所述miRNA-9的序列如SEQ？ID？NO.1所示。通过研究发现，miRNA-9在高转移能力的小鼠肝癌细胞中的表达量显著低于不具有转移能力的小鼠肝癌细胞，同时本发明还发现上调miRNA-9后小鼠肝癌细胞的增殖、侵袭、转移和黏附能力均减弱。因此认为，miRNA-9可以抑制小鼠肝癌细胞的转移，降低小鼠肝癌细胞的恶性程度。针对具有转移能力的小鼠肝癌细胞，将miRNA-9或其类似物miRNA-9的mimic制备成抑制肿瘤转移的药物，或也可以构建miRNA-9的真核表达载体，用于基因治疗。
【IPC分类】A61K31/7105, A61K48/00, A61P35/04
【公开号】CN105497917
【申请号】CN201510920950
【发明人】张嘉宁, 韩逸, 李文利
【申请人】大连理工大学
【公开日】2016年4月20日
【申请日】2015年12月11日