发动蛋白1在防治肠道病毒71型感染中的应用
【技术领域】
[0001] 本发明设及生物医学技术领域，具体设及抗肠道病毒71型感染的新祀点及应用。
【背景技术】
[0002] 肠道病毒71型（enterovirus 71，EV71)属于小核糖核酸病毒科肠道病毒属人肠道 A类病毒，是导致手足口病化and-foot-mouth disease，HFMD)的主要病原体之一。目前，手 足口病在世界多个地区暴发并流行，尤其是亚太地区。在我国，自2008年几大省市暴发手足 口病疫情W来，该病的感染人数和死亡率一直居高不下，每年报告发病数超过100万例，死 亡数近1000例。手足口病主要发病人群为5岁W下婴幼儿，临床表现为发热，手、足、臀部W 及口腔粘膜等部位出现瘤疹等症状；少数患儿可发展为重症患者，出现中枢神经系统 (central nervous system，CNS)病变，包括无菌性脑膜炎、脑干脑炎、脑脊髓炎W及神经源 性肺水肿等，严重威胁着婴幼儿的生命健康[Solomon T,Lewthwaite P,Perera D,(^irdosa MJ,McMinn P,Ooi MH.Virology,epidemiology,pathogenesis,and control of enterovirus 71 丄ancet Infect Dis.2010Nov;10(ll):778-90.]。手足口病特别是重症病 例多由肠道病毒71型化V71)感染所致。然而，目前关于EV71引起手足口病的治疗尚无特异 高效的抗病毒药物，临床上仍W对症治疗为主，在预防方面也无有效疫苗问世。
[0003] EV71感染具有嗜神经性，易造成严重的CNS疾病及其并发症，运也是导致手足口病 患者发展为重症甚至死亡的主要原因。其中，脑干是最易被EV71感染的部位[Tee，K.K.，et 曰1.Evolutionary genetics of human enterovirus 71:origin,population dynamics, natural selection,and seasonal periodicity of the VPlgene.J Virol,2010.84(7): P. 3339-50.]，研究证实在EV71重症患者的脑干神经元等部位均能够检测到EV71基因及抗 原的存在，证明EV71能进入CNS。EV71经血液播散破坏血脑屏障或经周围神经途径逆向轴突 输送感染CNS。但EV71引起的中枢神经系统症状的机制尚不明确[Solomon T，Lewthwaite P,Perera D,Cardosa MJ,Mcminn P,Ooi MH.Virology,epidemiology,pathogenesis,and control of enterovirus 71 丄ancet Infect Dis.2010; 10:778-90.]。神经母细胞瘤细胞 (甜-SY5Y)为神经组织来源，具有一定的神经细胞特性。因此，探明EV71感染甜-SY5Y的机制 并W此寻找新的抗病毒祀点，对于防治EV71所导致的中枢神经系统感染至关重要。
[0004] 为了有效地感染细胞，病毒必须利用宿主细胞的膜分子及其囊泡运输系统完成对 宿主细胞的入侵，才能在细胞内进行复制并释放出有感染性的子代病毒颗粒。因此，作为病 毒感染宿主细胞的首要环节，细胞入侵已成为抗病毒药物筛选的重要祀标。研究表明，EV71 可利用不同的宿主因子和感染途径来入侵不同种类的祀细胞，比如EV71感染化rkat T淋己 细胞系主要利用小窝依赖的内吞途径（caveolar-d邱endent endo巧tosis) [Lin HY,Yang YT,Yu SL,et al.Caveolar endocytosis is required for human PSGL-1-mediated enterovirus 71 inf ection. J Virol. 2013，87( 16): 9064-76.]。目前，关于EV71 感染細-SY5Y的途径及机制仍不清楚。
[000引病毒侵入祀细胞主要借助了参与宿主细胞自身物质运输的关键分子，运些宿主细 胞膜转运分子在细胞的跨膜物质运输，囊泡的形成、内吞W及分泌中发挥着重要的作用。如 金属蛋白酶调节了细胞粘附，细胞膜分子的降解；小窝蛋白家族分子caveolin-l(CAVl)、 caveolin-2(CAV2)、caveolin-3(CAV3)将物质运输至高尔基体;Flotillin分子能够与脂俊 内蛋白分子相互作用并内吞入细胞内；发动蛋白I(DNMl)通过影响囊泡的重新利用在细胞 的内吞和突触囊泡循环中发挥重要作用;GTP酶激活蛋白分子GRAFl在网格蛋白非依赖型的 囊泡运输中具有重要的调节作用；白细胞介素2受体内吞调节了信号通路并影响了细胞增 歹直（Jason Mercer,Mario Schelhaas,et al.Virus Entry by Endocytosis.Annu Rev Biochem. 2010; 79:803-833.) eEzrin蛋白可通过酪氨酸激酶信号调节细胞微管系统，继而 调节了细胞黏附与迁徙等生理过程;Ezrin蛋白也被证实参与了丙型肝炎病毒感染肝细胞 的过程（Bukon邑 TN,Kodys K,Szabo G.Human ezrin-moesin-radixin proteins modulate hepatitis C virus infection.Hepatology.2013,58(5):1569-79.)。外被蛋白复合体 COPA(coatomer protein complex)参与了小泡介导非选择性运输,它参与从内质网到顺面 高尔基体的运输。在运些分子中，caveolin-1被证实参与了EV71感染化rkat T淋己细胞的 过程，而其它分子在EV71感染中的作用还未有报道。
[0006] 胞吞化11(1〇(3八0313)是细胞生理代谢的一个极为重要的过程，也是细胞从环境中 获取物质和回收膜组分的过程。发动蛋白（dynamin)家族是一类鸟巧酸S憐酸酶，是细胞在 进行内吞过程中特异的一种蛋白，它参与囊泡从细胞膜上出芽和剪切的过程。其中发动蛋 白UD醒1)特异性地分布在神经细胞中。现已证实面M 1通过水解GTP提供能量，使网格蛋白 包被的囊泡凹窝与突触前膜分离，最终回收至突触前膜重新利用从而在细胞内吞和突触囊 泡循环中发挥重要作用（Newton AJJirdihausen T,Mu;rthy VN. InMbition of dynamin completely blocks compensatory synaptic vesicle endocytosis.PNAS,2006,103 (47) :17955~17960)。现已证实D醒I在阿尔默茨海默症的发生发展中发挥作用(Brent LK, Robert V,Adriana F,et al.P-amyloid-induced dynamin !depletion in hippocampal neurons.A potential mechanism for early cognitive decline in Alzheimer disease[ J]. J Biol 化 em. 2005.280(36): 31746-31753.)。也有文献报 DNMl 可能通过憐酸 化/去憐酸化方式参与侧颠叶癒癖的发生发展(Cla^on EL，Anggono V，Smillie KJ，化au N,Robinson PJ,Cousin MA.The phospho-dependent dynamin-syndapin interaction triggers activity-dependent bulk endocytosis of synaptic vesicles[J].J Neurosci,2009,29(24):7706-7717. )〇
[0007] 目前还没有任何关于D醒I分子在EV71感染人神经母细胞瘤(SH-SY5Y)中作用的研 究报道，对于DNMl分子进行深入研究不仅能够提升对EV71感染与致病机制的认识，也可W 为预防与治疗EV71感染提供新的思路与祀点。
【发明内容】
[0008] 本发明的目的在于提供一种抗肠道病毒71型感染的新祀点。
[0009] 本发明的另一目的在于提供发动蛋白I(DNMl)分子的新用途，特别是在抗肠道病 毒71型感染中的应用。
[0010]本发明的第S目的在于提供干扰DNMl分子表达的siRNA。
[0011]本发明的主要技术方案是：
[0012]本发明，W人神经母细胞瘤（SH-SY5Y)作为祀细胞，采用RNA干扰技术下调祀细胞 宿主蛋白的表达，来寻找可有效抑制EV71感染人神经母细胞瘤(SH-SY5Y)的宿主因子，从而 预防神经系统感染与破坏。本实验选择了一组宿主细胞跨膜转运分子来进行筛选，运些分 子在宿主细胞的跨膜物质运输，囊泡的内吞与分泌中发挥着重要作用，它们往往也是在病 毒感染过程中易被病毒"劫持"并利用的分子。运些分子包括:金属蛋白酶lO(ADAMlO)、发动 蛋白 I(DNMl)、caveolin-l (CAVl)、caveolin-2(CAV2)、caveolin-3(CAV3)、Flotillin蛋白 1 巧LOTI)、GTP酶激活蛋白（GRAFl)、白细胞介素2受体（IL2RB)、化rin蛋白、外被蛋白复合体 (COPA)。通过检索NCBI GeneBank得到全序列和mRNA序列，利用现有的网络资源及常用软件 对运些基因进行生物学分析，选择编码区作为SiRNA设计的祀序列，然后设计SiRNA,通过下 调运些分子，来观察对EV71感染的影响。
[001引我们发现发动蛋白I(DNMl)在EV71感染甜-SY5Y中发挥着重要的作用，下调DNMl的