蔗糖脂肪酸酯嵌入式阳离子脂质体基因载体系统及其制备方法和应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物技术领域，特别是薦糖脂肪酸醋嵌入式阳离子脂质体基因载体系 统及其制备方法。 技术背景
[0002] 基因治疗(gene therapy)是指将外源正常基因导入祀细胞，W纠正或补偿因基因 缺陷和异常引起的疾病，W达到治疗目的。1990年美国国立卫生研究院采用基因治疗方法 对腺巧脱氨酶缺陷症进行治疗，首次将基因治疗应用到临床并取得了成功。2000年采用基 因治疗方法成功治疗联合免疫缺陷综合症，表明了基因治疗策略的有效性。基因治疗要得 到进一步的发展，必须克服=个方面的难题:一、要有用于治疗的目的基因和接受目的基因 的细胞;二、实现基因表达的可调控性;=、获得具有祀向性的高效的基因导入系统。其中， 具有祀向性高效的基因导入系统，即基因载体成为制约基因治疗发展的关键因素。
[0003] 基因载体主要有两大类:病毒基因载体，非病毒基因载体。自从首次成功进行了基 因治疗的临床试验W来，大部分采用转染效率高的病毒载体，但是病毒载体具有很高的免 疫原性，易于与野生型病毒重组，载量有限、生产成本高且易被污染。1999年美国宾州大学 W重组病毒为载体的基因治疗药物在临床试验中造成一名18岁受试者死亡。2000年法国内 克尔医院在治疗重症联合免疫缺陷病的过程中应用逆转录病毒载体，在2003年发现有几名 儿童产生了白血病。因此病毒载体的发展受到了限制。非病毒基因载体与病毒基因载体相 比，虽然转染效率相对较低，但具有低免疫原性、低毒、外源基因整合率低，无基因插入片段 大小限制、甚至可运载细胞核或染色体、使用简单，制备方便等优势。越来越多的研究人员 开始选择非病毒载体进行基因治疗方面的研究。阳离子脂质体是目前研究最透彻、技术最 成熟、应用最广泛的非病毒载体系统，具有类细胞结构和生物膜的特性，在体内可降解，可 W保护其运载基因片段的生物活性。但其也存在一定的局限性，如细胞毒性大，对器官的祀 向性不明显，基因转运机制不明确等，限制了阳离子脂质体的发展。因此，人们一直致力于 对阳离子脂质体的各种构建及修饰，试图寻求一种高效低毒的基因治疗药物。
[0004] 薦糖醋是一种非离子表面活性剂，由薦糖和脂肪酸经醋化反应生成的单质或混合 物。薦糖醋具有广泛的亲水亲油平衡值(化B)，具有良好的分散、增溶性能。因此，薦糖醋做 为助类脂用于制备脂质体可W增强脂质体的分散性，增强脂质体与药物的配伍作用，加快 药物释放速度、促进分散、防止结晶沉淀，并延长药物保质期限。另外，薦糖醋生物相容性、 生物降解性强，用于制备阳离子脂质体可降低脂质体的毒性。
【发明内容】
[000引本发明的目的是提供一种细胞毒性小、在体外和体内基因转染效率高的薦糖脂肪 酸醋嵌入式阳离子脂质体基因载体系统及其制备方法及其应用，克服现有技术的不足。
[0006]本发明的薦糖脂肪酸醋嵌入式阳离子脂质体基因载体系统由薦糖脂肪酸醋嵌入 式阳离子脂质体与基因物质组成，所述的薦糖脂肪酸醋嵌入式阳离子脂质体由阳离子类脂 和薦糖脂肪酸醋构成。
[0007] 本发明的薦糖脂肪酸醋嵌入式阳离子脂质体基因载体系统，其中所述薦糖脂肪酸 醋为单醋或双醋，其中单醋结构如下：
其中，R选自硬脂酸或月桂酸或油酸或栋桐酸或肉違酸或芥酸； 所述的薦糖脂肪酸醋的亲水亲油平衡值为:化B<1或1含化B < 16。
[0008] 本发明的薦糖脂肪酸醋嵌入式阳离子脂质体基因载体系统，其中所述阳离子类脂 为肤型阳离子类脂，结构式为：
或双子型阳离子类脂，结构式为：
或季锭盐型阳离子类脂，结构式为：
其中：X选自1~6;y选自1~8;R选自C8-2Q烷基，该烷基包括直链烷基和支链烷基;AA选 自精氨酸或组氨酸或天冬氨酸或丙氨酸或甘氨酸或鸟氨酸或赖氨酸;B选自Orn或Lys。
[0009] 本发明的薦糖脂肪酸醋嵌入式阳离子脂质体基因载体系统，其中所述的阳离子类 脂与薦糖脂肪酸醋的质量比为1:8~8:1;所述薦糖脂肪酸醋嵌入式阳离子脂质体与基因物 质的质量比为0.5:^32:1。
[0010] 本发明的薦糖脂肪酸醋嵌入式阳离子脂质体基因载体系统，其中所述的基因物质 为质粒DNA或小干扰RNA。
[0011] 本发明的薦糖脂肪酸醋嵌入式阳离子脂质体基因载体系统的制备方法，步骤如 下： 薦糖脂肪酸醋嵌入式阳离子脂质体的制备： (1) 将阳离子类脂和薦糖脂肪酸醋按照质量比1:8~8:1比例溶解于氯仿或甲醇中得溶 液； (2) 将（1)步骤得到的溶液在氮气下吹成均匀薄膜，真空干燥2~12h; (3)用乙醇或水或生理盐水或憐酸作为缓冲液或W乙醇、水、生理盐水、憐酸中的任意 两种等质量的混合液进行水化，水化溫度为10~80°C;水化时间为1~lOh，超声震荡至澄 清，得到薦糖脂肪酸醋嵌入式阳离子脂质体，浓度为0.5~3.Omg/mL该薦糖脂肪酸醋嵌入 式阳离子脂质体为分散在水相中形成的粒径大小为150~250nm的均一稳定的表面带有正 电荷的阳离子脂质体； 利用薦糖脂肪酸醋嵌入式阳离子脂质体与基因物质制备薦糖脂肪酸醋嵌入式阳离子 脂质体基因载体系统： 将薦糖脂肪酸醋嵌入式阳离子脂质体与质粒DNA或小干扰RNA，通过静电相互作用形成 分散在水相中均一稳定的纳米颗粒，具体步骤如下： (1) 取薦糖脂肪酸醋嵌入式阳离子脂质体分散在细胞培养液DMEM或RPMI1640中，混 匀，使浓度为0.0 1μg/μL~0.6化g/yL (2) 将0.5~1. Oyg质粒DNA或小干扰RNA稀释在细胞培养液DMEM或RPMI1640中，混匀， 使质粒浓度为0.0化g/y L (3) 按照薦糖脂肪酸醋嵌入式阳离子脂质体与基因物质质量比0.5:1~32:1比例，将 (1)和(2)两稀释液混匀，室溫放置10~40min，即可得到薦糖脂肪酸醋嵌入式阳离子脂质体 基因载体系统。
[0012] 本发明的薦糖脂肪酸醋嵌入式阳离子脂质体基因载体系统的制备方法制备的薦 糖脂肪酸醋嵌入式阳离子脂质体基因载体系统在细胞转染中的应用及在体内转染中的应 用，主要包括： 1、所述薦糖醋嵌入式阳离子脂质体基因载体可进入癌细胞中，完成目的基因在细胞内 的转染。
[0013] 2、所述细胞为人宫颈癌细胞(Hela)和非小肺腺癌细胞(A549)。不同氮憐比下结合 获得的所述薦糖醋嵌入式阳离子脂质体基因载体系统，在不同细胞内的转染效率会有所差 异。
[0014] 3、所述薦糖醋嵌入式阳离子脂质体基因载体系统可进入荷瘤小鼠癌细胞中，完成 目的基因在细胞内的转染。
[0015] 4、本发明提供的薦糖醋阳离子脂质体基因载体适用于编码巧光素酶、绿色巧光蛋 白报告基因，也适用于其他各种实验所需的siRNA。该载体能高效运载pDNA和SiRNA转染细 胞。
[0016] 5、所述薦糖醋嵌入式阳离子脂质体基因载体系统对细胞和小鼠几乎不产生毒性。
[0017] 本发明与现有技术相比具有如下优点： 1、本发明提供的薦糖脂肪酸醋嵌入式阳离子脂质体基因载体系统，采用的助类脂为薦 糖醋。薦糖醋是一种非离子表面活性剂，具有广泛的亲水亲油平衡值(HLB),具有良好的分 散、增溶性能。薦糖醋做为助类脂用于制备脂质体可W增强脂质体的分散性，增强脂质体与 药物的配伍作用，加快药物释放速度、促进分散、防止结晶沉淀，并延长药物保质期限。
[0018] 2、本发明提供的薦糖脂肪酸醋嵌入式阳离子脂质体基因载体系统，采用的薦糖 醋具有良好的生物相容性、良好的生物降解性，可降低季锭盐型脂质体的毒性。
[0019] 3、本发明提供的薦糖脂肪酸醋嵌入式阳离子脂质体基因载体系统，制备方法简 单，采用的反应试剂及得到的产物无毒无污染，且原料成本低，可广泛应用于科学研究及生 产。
[0020] 4、本发明所述的薦糖脂肪酸醋嵌入式阳离子脂质体基因载体系统稳定性好，粒 径为200nm左右，可压缩更多带负电的基因物质，提高体外体内转染效率、细胞相容性好、毒 性小，可作为新型高效低毒的非病毒基因载体和转染试剂。
[0021] 5、本发明提供的薦糖脂肪酸醋嵌入式阳离子脂质体基因载体系统，在运载SiRNA 用于基因沉默时也有