一种薄荷叶抗氧化活性有效部位及其制备方法和应用
【技术领域】
[0001] 本发明具属于医药领域，设及薄荷叶抗氧化活性有效部位及其制备方法，还设及 薄荷叶抗氧化活性部位在制备抗氧化保健产品中的用途。
【背景技术】
[0002] 自由基是人体疾病和衰老的直接制造者，人寿命的长短与自由基的产生及人体内 抗氧化剂的浓度有着密切的关联。增加抗氧化剂的摄入量可有效降低癌症高发人群的发病 率。然而研究发现，合成的抗氧化剂对人体具有潜在的威胁，因此，研究开发广谱、高效、安 全的天然抗氧化剂已成为当今研究的热点之一。
[0003] 中草药资源是我国宝贵的财富，很多中草药都含有丰富的抗氧化成份，薄荷 (M. canadensis L.)是唇形科化abia1:ae)薄荷属(Mentha L.)植物，为我国传统中药，近年 来研究发现，其中富含多种对人体健康有益的物质表现出良好的抗氧化能力[She G，Xu C, Liu B, et al. J Food Sci, 2010，75(4): C359-C362]。经对现有技术文献检索发 现，国外对抗氧化活性研究多集中于该属的其他种如留兰香M. spicata和椒样薄荷M. X piperita等，该种在我国则作为中药薄荷伪品不能用于药材流通。而国内对薄荷研究多集 中于挥发性成分中，对于叶片中非挥发性成分的抗氧化活性少有报道。在对我国传统药食 同源中药综合利用其非挥发性成分研究发现其提取物具有良好的抗氧化活性。
【发明内容】
[0004] 本案发明人在发现薄荷叶提取物具有潜在的抗氧化活性的基础上在体外抗氧化 活性的指导下，研究了该有效部位的提取方法，并从该部位中获得了主要化学成分的分离 纯化。
[000引本发明目的是克服现有技术的不足，提供一种物质基础明确、活性与机制清晰的 薄荷叶抗氧化活性有效部位及该有效部位的制备方法和其在抗氧化保健产品中的应用。
[0006] 为了达到上述目的，本发明采取的技术方案为： 薄荷干燥叶片25kg，用50-70 %乙醇按料液比1:5-1:8,常溫浸提15-20 d，连续提取2-3 次，滤过后合并提取液，用旋转蒸发仪减压浓缩得浸膏，加水使成为混悬液，正下醇萃取4 次，合并提取液，减压回收，得正下醇部位约500g，经打孔树脂HPD-600色谱分离，用水洗脱 至无色，再用70%乙醇洗脱后收集洗脱液，浓缩干燥获得薄荷叶抗氧化有效部位。
[0007] 本发明采用DPPH、ABTS两种抗氧化模型体外评价确定该有效部位抗氧化活性。 DPPH自由基清除中EC50值越小说明清除率越高，正下醇部位显著高于其他部位。ABTS实验 表明正下醇EC50值为4.93 ± 0.25。
[000引表1薄荷不同溶剂提取物对DPPH自由基清除的EC50值(P<0.05)
本发明的薄荷叶抗氧化有效部位中主要成分包括咖啡酸、原儿茶酸、熊果酸、坡莫酸、 香木叶素、2a，3a-二径基-12締-28-乌簇酸、2a-径基齐墳果酸、迷迭香酸、刺槐素-7-O-0-D-葡萄糖巧、木犀草素、木犀草素-7-O-0-D-葡萄糖巧。
[0009] 本发明的薄荷叶抗高尿酸血症有效部位制备方法优点为工艺简单，操作方便，技 术易掌握，能耗小，溶剂可回收循环使用，生产成本低。
[0010] 本发明的薄荷叶抗氧化有效部位在制备薄荷保健产品中应用，特别是在制备抗氧 化保健产品中应用。
[0011] 本发明还提供用本发明的薄荷抗氧化有效部位W及保健食品上可接受的载体或 赋形剂制备的药物制剂。运些药物制剂选自W下剂型:片剂、糖衣片剂、薄膜衣片剂、肠溶衣 片剂、泡腾片剂、胶囊剂、硬胶囊剂、软胶囊剂、微囊剂、微球剂、颗粒剂、丸剂、散剂、膏剂、口 服液、混悬剂、溶液剂、冻干粉。
[0012] 本发明的含有薄荷叶抗氧化有效部位保健品制剂，在制备制剂时可加入可接受的 载体，所述载体来自：抗氧剂、塞合剂、表面活性剂、填充剂、崩解剂、湿润剂、溶剂、缓释材 料、肠溶材料、pH调节剂、矫味剂、色素等，常用载体如:甘露糖醇、右旋糖巧、乳糖、葡萄糖、 山梨醇、木糖醇、注射用水、注射用乙醇、氯化钢、娃衍生物、纤维素、纤维素衍生物、明胶、聚 乙締化咯烧酬、甘油、吐溫80、琼脂、碳酸巧、聚乙二醇、环糊精、憐脂类材料、滑石粉、硬脂酸 儀、硬脂酸巧等。
【附图说明】
[0013] 图1、2本发明采用现代分离鉴定技术对抗氧化有效部位化学成分进一步分离鉴定 得到各化合物结构图。
【具体实施方式】
[0014] 实施例1 薄荷叶抗氧化活性部位的提取与分离：薄荷干燥叶片25kg，用70 %乙醇按料液比1:5， 常溫浸提15-20 d，连续提取3次，滤过后合并提取液，用旋转蒸发仪减压浓缩得浸膏，加水 使成为混悬液，正下醇萃取4次，合并提取液，减压回收，得正下醇部位约500g，经打孔树脂 HPD-600色谱分离，用水洗脱至无色，再用70%乙醇洗脱后收集洗脱液，浓缩干燥获得薄荷叶 抗氧化有效部位。
[001引实施例2 体外抗氧化活性测定:清除DPPH自由基实验，、取不同提取物，DMSO溶解，配制成IOmg/ mL母液。DPPH用无水乙醇配制成0.16mmol/L，置于栋色瓶中备用。在96孔板中，每孔分别入 20化不同浓度的样品溶液、8化L超纯水和I(K)化的0.16mmol/L DPPH，反应体系20化L。加 样后室溫避光振荡15min，将96孔板放入酶标仪中在517nm波长处检测样品的吸光度(Ai); 取20 ml DMSO代替样品溶液测得空白吸光度(AO) ; W10化L无水乙醇代替DPPH溶液测得样 品本底吸光度(Aj);每个浓度做4个平行对照，取其平均值。WVC做阳性对照，按公式（1)计 算清除率，并计算EC50值。
[0016]
表1薄荷不同溶剂提取物对DPPH自由基清除的EC50值(P<0.05)
清除ABTS自由基实验ABTS混合液的制备：将7mmol/L ABTS水溶液与2.45mmol/L过 硫酸钟水溶液(终浓度)混合，将混合液在室溫避光条件下放置12~1化，形成ABTS储备液。将 此工作液与乙醇按照约1:20(v/v)比例混合，在734nm下调吸光度为0.700 ±0.02即得，于 30°C下预热备用。在96孔板中，每孔分别入10化不同浓度的样品溶液和19化L ABTS混合液， 反应体系20化L。反应10s，静置IOmin，将96孔板放入酶标仪中在734nm波长处检测样品的吸 光度(Ai );取10化DMSO代替样品溶液测得空白吸光度(Ao); W19化L无水乙醇代替ABTS混 合液测得样品本底吸光度(Aj );每个浓度做4个平行，取其平均值。W Vc做阳性对照，按公式 (1)计算清除率，并计算ECso值。
[0017]表2薄荷不同溶剂提取物对ABTS自由基的清除的ECso值(P<0.05)
实施例3 薄荷叶抗氧化有效部位化学成分的分离与鉴定： 薄荷叶抗抗氧化有效部位经ODS柱色谱和制备液相色谱分离得到10个化合物，利用 MS、iH-NMR、Uc-NMR数据鉴定化合物的结构为:搬皮素（1)、原儿茶酸(2)、熊果酸(3)、坡莫酸 (4)、香叶木素巧）、化，3a-二径基-12締-28-乌簇酸(6)、化-径基齐墳果酸（7)、咖啡酸(8)、 迷迭香酸(9)、刺槐素-7-O-0-D-葡萄糖巧（10)、木犀草素（11)、木犀草素-7-O-0-D-葡萄糖 巧（11)。其中原儿茶酸、香叶木素、木犀草素、木犀草素-7-O-0-D-葡萄糖巧首次在薄荷中分 离得到，坡莫酸、2a，3a-二径基-12締-28-乌簇酸、2a-径基齐墳果酸、刺槐素-7-O-0-D-葡萄 糖巧首次在薄荷属植物中分离得到。
[001 引 化合物1:黄色粉末诚60的，]?8 111八：302.04([]\?1] + )。1护醒1?(0150,5001化）5: 12.47(1H, S, 5-OH), 10.76(1H, s, H-7), 9.39(1H, s, H-3), 8.52(2H, d, J=8.5, H-3'，4')， 7.64(1H， d, J=2Hz, H-2')， 7.52(1H， d, J=2Hz H-6')， 6.78(1H， s, H), 6.42(lH，s，H)，6.21(lH，s，H);UC-NMR(DMS0，125MHz)S:174.81(C-4)，162.53(C-7)，160.04(05)，156.31(09)，147.52(C-4'），146.82(02)，144.83(C-3'），135.48 (C-3), 121.91(C-r), 119.83(C-6，），115.54(C-5，），115.24(C-2，），104.39(010)， 98.3KC-6), 92.9(C-8)〇
[0019] 化合物2:白色针状结晶诚6〇於，]\18 111八：155.12([]\?1] + )。1护醒1?化2〇,5001化） 5:7.42(lH，d，J=2HzH-2)，7.39(lH，d，J=8HzH-6)，7.37(lH，d，J=8HzH-5);UC-NMR(D20, 125MHz)S: 177.03(07)，150.03(03)，146.03(04)，131.30(01)，124.24 (C-6), 119.63(05)，118.11(02)。
[0020] 化合物3:白色粉末(MeOH)，mp:272-273°C;MS m/z: 457.37([M+H] + )，故而推断 其分子式为C3〇H48〇3 eUc-NMR(PYR, 125MHz)S: 179.88(028)，139.28 (C-13), 125.66 (C-12), 78.14(03)，55.84(05)，53.57(018)，48.06(09,17)，42.52(014)， 39.99(C-8), 39.51(019)，39.42(C-4), 39.39(C-1), 39.10(020)，37.46(010)， 37.30(C-22), 33.60(C-7), 31.09(C-21), 28.83(C-23), 28.71 (C-15), 28.15 (C-2), 24.93(016)，23.93(027)，23.65(011)，21.43(030)，18.80(C-6), 17.54(029)， 17.47(026)，16.59(025)，15.70(024)。
[0021 ]化合物4:白色粉末(MeOH)，MS m/z: 495.34([M+化]+ )dUc-NMR(PYR, 125 MHz) S: 180.77(028)，139.66(013)，127.83(012)，78.09(03)，72.51(019)，55.65 (C-5), 54.37(018)，48.11(017)，47.53(C-9), 42.14(020)，41.83(014)，40.09 (C-8), 39.1KC-4), 38.80(C-1), 38.27(C-22), 37.OS(C-IO), 33.33(C-7), 29.06(C- 15) , 28.56(C-23), 27.67(C-2), 26.90(C-21), 26.68(C-29), 26.13(C-16), 24.48(C-27)，23.78(011)，18.69(