垂丝海棠提取物和活性化合物、制备方法及应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于医药和/或保健品技术领域，具体设及一种垂丝海棠提取物和从垂丝 海棠花中分离得到的活性化合物、制备方法，W及其在抗凝血方面的新用途。
【背景技术】
[0002] 垂丝海棠 (Malus halliana Koehne)是菩薇科苹果属植物。垂丝海棠，气微，味微 苦、涩，性平，归肝经，有调经和血的功效，主要用于治疗血崩。垂丝海棠与同科的贴梗海棠 (C. speciosa)、西府海棠（M. micromalus)和木瓜海棠（C. cathayensis)并称"海棠四 品"。查阅文献发现:垂丝海棠具有保肝、抗氧化、体外抑制Q-葡萄糖巧酶活性，而且垂丝海 棠花、叶和果实中都有一定的活性成分，药用价值较高。但对垂丝海棠的研究主要集中在园 林美化、栽培繁育、保健饮料、生物活性方面，化学成分仅见脂溶性成分的报道。
[0003] 血液凝固简称凝血，是在内源性或（和）外源性凝血途径下产生凝血酶原激活物， 凝血酶原激活物在凝血因子的作用下产生凝血酶，最后凝血酶使纤维蛋白原转变为纤维蛋 白，血液由溶胶状态转变为凝胶状态。凝血过程通常分为:①内源性凝血途径;②外源性凝 血途径;③共同凝血途径。外源性凝血途径是从组织因子暴露于血液而启动，到因子X被激 活的过程；临床上W凝血酶原时间（PT)测定来反映外源性凝血途径的状况。内源性凝血途 径是指从因子XII激活，到因子村敦活的过程；临床上W活化部分凝血活酶时间（APTT)来反 映体内内源性凝血途径的状况。从因子X被激活至纤维蛋白形成，是内、外源共同凝血途径； 主要包括凝血酶生成和纤维蛋白形成两个阶段。
[0004] 血栓形成是许多疾病如屯、肌梗死、缺血性卒死、深静脉血栓等的基本病理过程，它 严重地危害着人类的健康，它的形成与血小板的聚集、粘附，内源性和外源性凝血系统W及 纤维蛋白的形成密切相关。根据世界卫生组织的调查报告，由于动脉粥样硬化导致的血栓 疾病引起的死亡已经排到了第一位。动脉血栓是由于动脉粥样硬化，斑块不稳定发生了斑 块的破裂，使血液里的血小板发生聚集，激活了体内的凝血系统，最后导致血栓形成。一旦 堵塞W后就会发生组织的缺血和坏死，产生严重的后果。在动脉血栓性疾病的急性或特殊 状态下，需要辅助使用抗凝血药物，才能达到更好的抗血栓效果。
[000引目前，尚无垂丝海棠花提取物和化合物宝蕾巧n、山奈酪-3-0-aA-巧喃阿拉伯糖 巧、根皮素-4'-0-葡萄糖巧、山奈酪-3-0-0寸-鼠李糖巧对家兔体外血浆凝血四项影响的报 道。本发明通过测定垂丝海棠花提取物和化合物对凝血四项的影响，考察其体外抗凝血作 用。
【发明内容】
[0006] 本发明目的在于克服现有技术缺陷，提供一种垂丝海棠提取物和从垂丝海棠花中 分离得到的活性化合物、制备方法，W及其在制备抗凝血药物方面的新用途。
[0007] 为实现上述目的，本发明采用如下技术方案： 一种垂丝海棠提取物的制备方法，其W垂丝海棠花为原料，将阴干的垂丝海棠花用70% 乙醇浸溃提取2-4次，每次2-4 d，提取液浓缩得到垂丝海棠花总浸膏;将垂丝海棠花总浸 膏用甲醇溶解，D-IOl型大孔树脂拌样、装柱，依次用水、20%甲醇、40%甲醇、60%甲醇、甲醇梯 度洗脱，每个浓度梯度洗脱5个柱体积，每个柱体积2000 mL，浓缩，分别得到水部位浸膏、 20%甲醇部位浸膏、40%甲醇部位浸膏、60%甲醇部位浸膏、甲醇部位浸膏。垂丝海棠提取物即 为垂丝海棠花总浸膏、40%甲醇部位浸膏、60%甲醇部位浸膏和甲醇部位浸膏中的一种或两 种W上的混合物。
[000引一种从60%甲醇部位浸膏中分离垂丝海棠活性化合物的方法，其将上述的60%甲醇 部位浸膏进行200-300目硅胶柱色谱分离，依次用体积比为100:0、90:10、80: 20、70: 30、 60:40、50: 50的二氯甲烧乙酸乙醋混合液、W及体积比为10:0、9:1、8: 2的二氯甲烧甲醇混 合液进行梯度洗脱，薄层色谱进行检测，相同成分合并，共得到11个组分;其中的第4组分经 过反复的硅胶柱色谱和凝胶柱色谱分离得到化合物1、2和4;其中的第6组分经过中压制备 液相色谱、硅胶柱色谱、Sephadex LH-20凝胶柱色谱分离得到化合物3。垂丝海棠花活性化 合物即为化合物1、2、3和4中的一种或两种W上的混合物。其中，化合物1、2、3、4分别为宝蕾 巧n、山奈酪-3-0-曰寸-巧喃阿拉伯糖巧、根皮素-4 ' -0-葡萄糖巧、山奈酪-3-0-aA-鼠李糖 巧(4)，其结构如图1所示。
[0009] 采用上述方法制备得到的垂丝海棠提取物。
[0010] 采用上述方法制备得到的垂丝海棠活性化合物。
[0011] 上述垂丝海棠提取物在制备抗凝血药物方面的应用。
[0012] 述垂丝海棠活性化合物在制备抗凝血药物方面的应用。
[0013] 上述垂丝海棠提取物和垂丝海棠活性化合物联合使用用于制备抗凝血药物。
[0014] 和现有技术相比，本发明的有益效果： 本发明提供具有活性化合物的来源植物垂丝海棠，其为菩薇科植物垂丝海棠 Malus halliana花。本发明从垂丝海棠花提取获得各部位，且从60%甲醇部位中进一步分离得到四 个化合物，并对垂丝海棠花各部位和活性化合物的体外抗凝血效果进行考察。结果表明：垂 丝海棠花各部位和化合物1-4均具有良好的抗凝血效果，且垂丝海棠花总浸膏抗凝血效果 比灯盏花素好。可见，它们可W单独或组合用于抗凝血剂。
【附图说明】
[001引图巧垂丝海棠花棘性化合物中化合物1-4的结构式； 图2为凝血机制图。
【具体实施方式】
[0016] W下结合实施例对本发明的技术方案作进一步地详细介绍，但本发明的保护范围 并不局限于此。
[0017] 下述实施例中所用垂丝海棠花采集于河南大学金明校区，为菩薇科苹果属植物垂 丝海棠 Malus halliana花。
[0018] 实施例1垂丝海棠花提取物及活性化合物的提取分离 一种垂丝海棠提取物的制备方法，其W垂丝海棠花为原料，将阴干的垂丝海棠花用 70V%乙醇浸溃提取3次，每次3 d，提取液合并、过滤、浓缩得到垂丝海棠花总浸膏。取部分垂 丝海棠花总浸膏用甲醇溶解，D-IOl型大孔树脂柱色谱分离，依次用水、20V%甲醇、40V%甲 醇、60V%甲醇、甲醇梯度洗脱，每个浓度梯度洗脱5个柱体积，每个柱体积2000 mL，浓缩，分 别得到水部位浸膏、20%甲醇部位浸膏、40%甲醇部位浸膏、60%甲醇部位浸膏、甲醇部位浸 膏。
[0019] -种从60%甲醇部位浸膏中分离垂丝海棠活性化合物的方法，具体为：将上述的 60%甲醇部位浸膏进行200-300目硅胶柱色谱分离，依次用体积比为100:0、90:10、80: 20、 70:30、60:40、50:50的二氯甲烧乙酸乙醋混合液、^及体积比为10:0、9:1、8:2的二氯甲烧 甲醇混合液进行梯度洗脱，薄层色谱进行检测，相同成分合并，共得到11个组分;其中的第4 组分经过反复的硅胶柱色谱和凝胶柱色谱分离得到化合物1、2和4;其中的第6组分经过中 压制备高效液相色谱、硅胶柱色谱、S巧hadex LH-20凝胶柱色谱分离得到化合物3。
[0020] 运用多种谱学技术鉴定化合物1、2、3和4的结构，结果如下： 宝蕾巧n(l):黄色结晶（甲醇），mp 156~158VH-NMR (CD3〇H，400Hz) 5:0.77 (3H，d, J=4Hz，rha-Me)，5.70 (lH，s，rha-l)，1.37 (3H，s，H-5")，1.44 (3H，s，H-4")，4.51 (lH，d, J=4Hz，H-2")，3.29 (2H，s，H-r)，6.37 (lH，s，H-6)，6.92 (2H，d，J=8Hz，H-3'，5'） ，7.78 (2H，d，J^Hz，H-2'，6'）；UC-NMR(CD3〇H，100Hz)S:159.3(C-2)，135.4(C-3)，179.5(C-4),163.2 (C-5)，95.0 (C-6)，165.9 (C-7)，105.9 (C-8)，158.6 (C-9)，99.9 (C-10)， 122.6 (C-r)，131.9 (C-2，，6，），116.5 (C-3，，5，），161.7 (C-4，），99.7 (rha-l)，74.7 (rha-2)，77.2 (rha-3)，79.5 (rha-4)，69.5 (rha-5)，17.0 (rha-6)，26.5 (C-r)，110.3 (C-2")，131.9 (C-3")，28.3 (C-4")，17.0 (C-5")。
[0021 ] 山奈酪-3-0-a-k^喃阿拉伯糖巧(2):浅黄色粉末，溶于甲醇，mp 230~23rCeEI- MS m/z:419[M+l]\iH-NMR (DMSO-ds,400Hz) 5:5.59,5.35,4.74,4.14,3.61,3.28,3.16 (糖的-CH和-OH信号），6.20(1H, d, J=4Hz, H-6)，6.45 (IH, d, J=4Hz, H-8)，6.88 (2H, d，J=8.0Hz，H-3'，5')，8.00(2H，d，J=8.0Hz，H-2'，6')，12.62(lH，s，5-OH);UC-NMR(DMS0-d6，100Hz)S:156.6(C