靶向识别肿瘤细胞的纳米碳晶药物载体及其制备方法
【技术领域】
[0001 ]本发明涉及一种靶向识别肿瘤细胞的纳米药物载体材料及其制备方法。
【背景技术】
[0002]目前抗肿瘤药物主要有细胞毒素药物和激素类及抗激素类药物。细胞毒素药物主要作用于DNA和RNA来组织肿瘤细胞的增殖和生命代谢;激素类以及抗激素类药物主要是作用于生命体来调节激素水平以达到杀死或者抑制肿瘤细胞的增殖和生命活动。这些抗肿瘤药物在作用于肿瘤细胞的同时也会作用于正常细胞，且对机体正常组织的损伤不亚于对肿瘤组织细胞的损伤。药物溢出血管外还会引起组织溃疡及坏死。另外，传统的化疗抗肿瘤药物存在无选择导向作用，在机体中的运输过程复杂且达到病理区的药物分子数量比例低，因此需要大量且长期持续用药，在增加治疗成本的同时，也对病人的身体造成不可逆的损伤。
[0003]基于肿瘤细胞在细胞形态、功能和新陈代谢方面与正常细胞存在巨大不同的特点，人们开发出了具有靶向性治疗癌症的药物。早期科学家们应用血清蛋白、明胶血红蛋白骨胶原等天然可降解的高分子材料和可降解的合成类聚合物作为靶向药物载体，然而其存在制备工艺极其复杂、产量无法控制等问题，从而最终无法在临床上广泛应用。
[0004]近年来，随着纳米生物技术的飞速发展，纳米颗粒的小尺寸带给其诸多优势。纳米粒子的优势在于粒径极细和表面活性高:粒径极细的高活性纳米颗粒表面经过功能化处理之后可以主动识别并进入肿瘤细胞内部将携带的药物分子释放以杀死肿瘤细胞。目前已有富勒稀和无机纳米粒子等开始被用作药物载体在体内运送药物。然而，现有的纳米药物载体在进行特征药物分子修饰时才会考虑进行主动运输蛋白的修饰，这种修饰效率低且不易长期有效附着在纳米药物载体表面，并且这种修饰并不具有普遍适用性。
【发明内容】
[0005]本发明的目的在于提供一种靶向识别肿瘤细胞的纳米碳晶药物载体，同时提供其相应的制备方法是本发明的另一个发明目的。
[0006]基于上述目的，本发明采取如下技术方案:靶向识别肿瘤细胞的纳米药物载体材料，包括纳米碳晶，所述纳米碳晶的表面的C原子上依次连接阿霉素和转铁蛋白。
[0007]所述纳米碳晶该碳晶为类球形形貌，碳晶表面的C原子与内层金刚石相的C原子构成C原子的二聚体结构，C原子的二聚体结构中的两个碳原子为非对称分布，晶格间距为0.21nm，平均粒径为R，O <R < I Onm，该碳晶的C含量为99?100%。
[0008]所述纳米碳晶由以下方法制得:a)酸洗提纯:将金刚石原料粉碎成10000目以上的细粉，依次采用浓硫酸与浓硝酸混合液、稀盐酸、氢氟酸对该细粉酸洗，然后使用去离子水清洗至清洗液PH接近于7; b)分选:将清洗后的物料进行离心分离，取上层液体进行4-7天沉淀分选，去除上层清液，将下层沉淀物干燥后即得。所述纳米碳晶为类球形形貌，纳米碳晶表面的C原子与内层金刚石相的C原子构成C原子的二聚体结构，C原子的二聚体结构中的两个碳原子为非对称分布；晶格间距为0.2 Inm;平均粒径为R ,0<R< 10nm；该碳晶的C含量为99?100%。
[0009]靶向识别肿瘤细胞的纳米药物载体材料的制备方法，包括以下步骤:
1)纳米碳晶的预处理:将纳米碳晶置于质量比2:1?4:1的浓H2SOV浓HNO3的混合液中，加热回流、离心沉淀;取沉淀先用蒸馏水洗涤至PH4.0?5.0，再用0.1?0.4mol.IZ1NaOH洗涤，并超声分散，然后用0.1?0.4mol.L-1HCl洗涤，并超声分散，再用去离子水洗涤烘干；
2)制备转铁蛋白一阿霉素物理复合液:
①PBS 缓冲液的配置:按 NaCl 6 ?10 g、KCl 0.2 ?0.8 g、Na2HP04.12H20 2 ?5 g、KH2PO4 0.2?0.8g称取各原料，加1500?2000mL蒸馏水，待完全溶解后调pH至7.0?7.5 ；
②转铁蛋白液:将转铁蛋白和PBS按质量比1.5:1?3.5:1混合制得转铁蛋白液；
③阿霉素液:将阿霉素和蒸馏水按10?20mg:5?1mL比例混合制得阿霉素液；
④转铁蛋白一阿霉素物理复合液:将②中的转铁蛋白液和阿霉素液按质量比2:1?4:1混合即得转铁蛋白一阿霉素物理复合液。
[0010]3)纳米碳晶与转铁蛋白一阿霉素物理复合液的组装:将步骤I)中经处理的纳米碳晶与步骤2)中的转铁蛋白一阿霉素物理复合液按质量比0.01:1?0.08:1混合，经超声乳化得到的乳化液，经去离子水洗涤至PH7.0?7.5后，离心沉淀，得到的沉淀物冷冻离心、真空干燥即得。
[0011]步骤II )中加热回流的温度为88?92°C，加热回流的时间为24?48h;离心的转速为 1000?2000rpmo
[0012]步骤II )中NaOH洗涤、超声分散过程重复至少3次，每次超声分散时间为I?3h;HCl洗涤、超声分散过程重复至少3次，每次超声分散时间为I?3h。
[0013]步骤2)的④中混合的具体操作为:在10?15°C下以50?10rpm的速度震荡2?4h。
[0014]步骤3)中超声乳化时间为2?lOmin，超声采用的功率为50?150W。
[0015]本发明采用气磨分选法制备得到纳米碳晶，其工艺简单、生产成本低且制备出的纳米碳晶的C含量在99?100%之间，纯度高，粒度范围分布窄，基本在O-1Onm之间，结晶性较强且表面活性强，吸附能力强，形貌规整可控，损失率低，损失率可控制在1%以内；制备出的纳米碳晶表面具有非对称分布的C原子的二聚体结构，具有很高的表面活性，很容易被表面功能化处理;具体地，本发明中采用的纳米碳晶，其优势在于:
1、高表面活性和高比表面积:纳米碳晶的表面存在着大量的两种不同形式的C原子，且该两种碳原子都处在活性状态，这些活性很高的位点极易对其进行表面功能化处理，经过表面功能化处理之后的纳米碳晶可以接入或者复合几乎所有的药物成分;而且经过活化处理后的纳米碳晶具有极高的比表面积使得其表面能够接入更多的药物成分和分子识别器，这样就会大大增加药物载体的靶向识别率，使得药物被更加有效的运送进入病理区；
2、极细粒度和良好的生物相容性:传统的纳米药物载体在人体中或通过生物降解来消除其残留或通过细胞吞吐作用排除体外，但都会有一定的残留且对人体产生不可逆转的损害;而纳米碳晶由于颗粒极细和良好的生物相容性，能够完全自由进出细胞从而被彻底排除体外；
3、表面功能化处理:传统的纳米药物载体以纳米颗粒作为内核，在纳米颗粒外层先聚合一层质子海绵体，再进行表面功能化处理(见图1)。在纳米颗粒外层聚合一层质子海绵体的结果使得纳米颗粒的比表面积下降和活性位点的数量降低且不可控。纳米碳晶本身其表面就有极丰富的活性位点，不需要在外层聚合其他具有表面活性功能的膜体，只需进行简单的预处理，便使其表面的活性位点“暴露”出来(见图2);
4、可以在其表面固定修饰主动运输蛋白。传统纳米药物载体只有在进行特征药物分子修饰时才会考虑进行主动运输蛋白的修饰，这种修饰效率低且不易长期有效附着在纳米药物载体表面。本发明在纳米碳晶进行表面药物功能化之前即可进行主动运输蛋白因子的普遍修饰，并且这种修饰具有普遍适用性;在纳米碳晶的活性表面固定修饰主动运输蛋白，经处理后的纳米碳晶具有主动运输的作用，可以克服细胞膜内外浓度差而被细胞主动吸收“逆向”进入肿瘤细胞组织，达到在肿瘤细胞组织内部的自由进出的效果。
[0016]基于此，本发明的技术原理在于:先将转铁蛋白和阿霉素进行物理复合;再将纳米碳晶进行预处理，获得更多的活性位点(图2);最后将转铁蛋白一阿霉素复合物吸附在纳米碳晶表面以制成具有靶向性主动运输的纳米药物载体(图3)。其中，转铁蛋白作为识别癌细胞的靶向因子;阿霉素是一类核酸合成干扰药物，其作用是嵌入DNA中干扰RNA对癌细胞基因的转录复制，利用纳米碳晶吸附转铁蛋白一阿霉素的复合物，最终达到阻止癌细胞分裂增殖的目的。具体地:
(1)转铁蛋白作为识别癌细胞的靶向因子。首先，铁是基体所必须的微量元素之一，对一系列细胞生命活动具有重要的作用，同时它也是一些重要酶的协同分子。但是，铁含量过多或过少都会对基体产生不可逆损伤，为此生物体已经发展了自身的调控机制，包括铁的摄取、存储和输出，以控制细胞内的铁处于平衡态。血浆中的转铁蛋白受体(TfR)是细胞摄取铁过程中的重要蛋白，细胞通过转铁蛋白的循环来不断地获取铁。由于癌细胞的生长和分裂速度会比正常细胞快，因此对铁的需求量也就更大，据研究，癌细胞表面转铁蛋白受体与转铁蛋白的亲和力是正常细胞的10?100倍。因此，本发明利用癌细胞和正常细胞表面转铁蛋白受体的差异，将药物与转铁蛋白偶联，可使其具有靶向性；
(2)阿霉素作为一类核酸合成干扰药物，本身具有毒性较弱、温和、中性，容易排出体外的特点(根据药理学记载:阿霉素以圆形和醇形代谢物的形式从胆汁和尿中排除。因此不会残留体内)。与转铁蛋白复合形成耦合物后，阿霉素由于分子较转铁蛋白小而先与纳米碳晶上的活性位点吸附结合，可保证有尽可能多的阿霉素被吸附，药物分子的修饰率提高，靶向因子(转铁蛋白)的修饰率也相应提高，更容易识别癌细胞；
因此，与现有技术相比，本发明的有益效果在于:其靶向性强、修饰率高，且可以在其表面固定修饰主动运输蛋白，具有普遍适用性的优势。
【附