一种新型荧光脂质体纳米探针及其制备方法
【技术领域】
[0001]本发明属于纳米技术和荧光诊断研究领域，特别涉及一种新型荧光脂质体纳米探针及其制备方法。
【背景技术】
[0002]焚光量子点(quantum dots，QDs )也称为半导体纳米晶体(semi conductornanocrystal)，是指在三维空间上达到一定临界尺寸(激子波尔半径)而具有量子限域效应的球形半导体材料，其粒径一般为2?10nm(2000?10000个原子)。通常有元素周期表的Π-VI或m-V族元素组成，目前研究较多的主要是CdX(X = S，Se，Te)材料。荧光量子点作为一种新型的无机荧光探针，具有许多独特的性质，能有效地克服有机荧光染料和荧光蛋白的一些致命弱点。主要表现为:(I)荧光量子点的激发光谱较宽且连续分布而且发射光谱较窄且对称分布，通常半峰宽为25?35nm，发射波长均可覆盖范围广(400nm?1350nm);(2)荧光量子点的发射波长可通过改变量子点的大小而加以调节，而其组成和表面性质无需改变。因此，可将不同大小的焚光量子点用单一波长的光激发而发射出不同颜色的焚光，从而实现一种材料的多色标记和多组分检测。而传统的荧光染料随着材料的不同，需要多种激发光激发，这样累积的能量很容易使受试样品特别是生物样品遭到破坏，而且由于其发射光谱宽，重叠现象重，因此难以实现多色标记和多组分检测；(3)荧光效率较高。(4)荧光量子点的光稳定性特别好，特别是核壳型荧光量子点，较传统的有机染料分子强数个数量级，而通过改进的表面修饰工艺还可进一步提高其光稳定性。(5)荧光量子点具有较长的荧光寿命(一般为20?50ns)，使得信号可以显著区别于背景和其他荧光基团，提高检测灵敏度。
[0003]叶酸(Folic acid)，是许多肿瘤组织生长必不可少的一种营养成分，为了比正常组织更快地生长，肿瘤细胞往往需要较正常细胞摄取更多的叶酸，因而许多肿瘤细胞(如卵巢癌、绒毛膜癌、以及乳腺、肺、肾、直肠肿瘤等)表面的叶酸受体表达十分丰富，叶酸受体在正常组织中很少或几乎不表达。近年来的研究认为，利用叶酸-叶酸受体之间能特异性结合的特性，将某些物质与叶酸结合，可以实现肿瘤靶向作用。
[0004]脂质体(liposome)，是结构类似生物膜的封闭型超微球体，骨架结构由磷脂双分子层构成的亲水性囊泡，这种结构使其能够携带各种亲水的、疏水的和两亲的物质。脂质体具有有效防止被包裹药物氧化、提高其稳定性和生物利用度、使被包裹药物具有靶向性、天然无毒、生物可降解、无免疫抑制作用等优点。
【发明内容】
[0005]本发明要解决的技术问题是提供一种具有荧光性能、靶向性、稳定性好且生物相容性尚的新型焚光脂质体纳米探针。
[0006]为了解决上述技术问题，本发明的技术方案为一种新型荧光脂质体纳米探针，该荧光脂质体纳米探针包含水溶性CdTe量子点、二棕榈酰磷脂酰胆碱、胆固醇、聚乙二醇-二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺和叶酸-聚乙二醇-二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺。
[0007]作为优选，所述二棕榈酰磷脂酰胆碱、胆固醇、聚乙二醇-二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺与叶酸-聚乙二醇-二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺的重量混合比例为75?85:10?20:4?5:0.5 ?I。
[0008]作为优选，所述二棕榈酰磷脂酰胆碱、胆固醇、聚乙二醇-二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺与叶酸-聚乙二醇-二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺的重量混合比例为80:15:4.5:0.5。
[0009]作为优选，所述的水溶性CdTe量子点的制备方法包括以下步骤:取Te粉0.1276g，加入0.15723g NaBH4，加入5mL超纯水，通高纯N2反应得到无色的无氧NaHTe溶液备用；将0.4566g CdCb.2.5出0溶于30mL蒸馈水中，加入350yL巯基丙酸，用0.1mol/LNaOH溶液调节pH值为12，然后用高纯N2在密闭体系中进行脱氧保护，加入200yL所述的无氧NaHTe溶液，将反应液加热至96°C回流lh。
[0010]作为优选，所述的叶酸-聚乙二醇-二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺的制备方法包括以下步骤:将62.5mg叶酸与1mL DMSO置于反应瓶中反应，加入250mg DSPE-PEG-Nh2和250yL吡啶，在81.5mgDCC的催化下得到反应液，通过旋转蒸发除掉吡啶，再加入31.25mL超纯水通过透析、微孔滤膜过滤，冷冻干燥。
[0011]本发明的另一目的，在于提供一种制备所述的一种新型荧光脂质体纳米探针的方法，包括以下步骤:按配比，称取二棕榈酰磷脂酰胆碱、胆固醇、聚乙二醇-二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺和叶酸-聚乙二醇-二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺，用有机溶剂溶解，旋转蒸发，形成薄膜，在40°C的条件下真空干燥I小时，加入所述水溶性CdTe量子点配制的溶液，经凝胶分离，得到脂质体溶液，再经挤压过膜，即得。
[0012]作为优选，所述的有机溶剂选自氯仿与甲醇的混合溶剂。
[0013]作为优选，所述的氯仿与甲醇的体积比为2:1。
[0014]作为优选，所述水溶性CdTe量子点溶液的浓度为30μπιΟI/L。
[0015]作为优选，所述的凝胶为SepharoseCL-4B凝胶;所述的挤压过膜采用具有10nm碳酸酯膜的脂质体挤压仪来进行。
[0016]采用脂质体包裹技术，在水溶性荧光量子点表面包覆一层脂质膜，不仅提高了荧光量子点的生物相容性，同时还减少了量子点中有毒元素的释放，提高荧光量子点的稳定性;在脂质材料中加入热敏成分，可以提高荧光脂质体纳米探针的物理靶向性，实现定位释放的能力;加入长循环脂质材料，可以延长荧光脂质体纳米探针在体内的循环时间；利用叶酸分子修饰脂质体表面，提高荧光量子点脂质体的肿瘤靶向性，进一步提高肿瘤荧光诊断的检测灵敏度和选择性且设备简单，操作容易掌握，为得到叶酸靶向荧光量子点脂质体纳米探针提供了安全高效的方法。
【附图说明】
[0017]图1叶酸靶向荧光量子点脂质体纳米探针荧光光谱图。
【具体实施方式】
[0018]下面结合附图对本发明的【具体实施方式】作进一步说明。在此需要说明的是，对于这些实施方式的说明用于帮助理解本发明，但并不构成对本发明的限定。此外，下面所描述的本发明各个实施方式中所涉及的技术特征只要彼此之间未构成冲突就可以相互组合。
[0019]实施一
[0020]1.仪器与试药
[0021]1.1仪器
[0022]仪器为磁力搅拌器;数显磁力搅拌器;加热套；电子天平;真空减压干燥机;冷冻干燥机。
[0023]1.2试药
[0024]叶酸(folicacid，^97%);N，N，-二环己基碳二亚胺(DCC 99% ) ；DSPE-PEG-NH2；吡啶；二甲基亚砜；氯化钠；甲醇；Te粉(99 % ); NaBH4(AR级)；巯基丙酸(AR级)；CdCl2.2.5H20(AR级)；石油醚(AR级)；高纯N2;实验用水为电阻率大于18ΜΩ.cm的超纯水。
[0025]2.荧光量子点合成方法:
[0026]水溶性CdTe量子点的制备:取Te粉0.1276g(lmmol)，加入0.15723g NaBH4，加入5mL超纯水，通高纯犯反应得到无色的无氧NaHTe溶液，通犯保存备用，即得新鲜制备的碲氢化钠溶液。将0.4566g CdCl2.2.5H20溶于30mL蒸馏水中，加入350yL巯基丙酸，用0.1mol/LNaOH溶液调节pH值为12。用高纯犯将溶液在密闭体系中脱氧保护，在适当的搅拌速度下，向溶液中加入200yL新制备的无氧NaHTe溶液，将反应液加热至96°C回流lh，即得到尺度较为均一的CdTe纳米粒子溶液(绿色荧光)。
[0027]3.叶酸-聚乙二醇-二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺的合成方法:将62.5mg叶酸与1mLDMSO置于反应瓶中反应，加入250mg DSPE-PEG(2000)-NH2和250yL吡啶，在81.5mgDCC的催化下得到反应液，通过旋转蒸发除掉吡啶，再加入31.25mL超纯水通过透析、微孔滤膜过滤，最后冷冻干燥得到黄色叶酸脂质材料(Folate-PEG-DSPE)。
[0028]4.叶酸靶向荧光量子点脂质体纳米探针的制备方法:按照配比DPPC:胆固醇:mPEG(2000) -DSPE: Fo Iate-PEG-DSPE = 80:15:4.5:0.5,总量为 20mg，称取各脂质材料置于 250mL茄形瓶中，经氯仿:甲醇=2:1混合有机溶剂溶解，通过旋转蒸发，形成一均匀薄膜，在真空干燥器中40°C干燥lh，再加入绿色荧光量子点水溶液8mL水化，经Sepharose CL-4B凝胶分离，得到脂质体溶液后，通过脂质体挤压仪(10nm碳酸酯膜)挤压过膜3次即得叶酸靶向荧光量子点脂质体纳米探针。
[0029]实施二
[0030]1.仪器与试药
[0031]1.1仪器
[0032]仪器为磁力搅拌器;数显磁力搅拌器;加热套；电子天平;真空减压干燥机;冷冻干燥机。
[0033]1.2试药
[0034]叶酸(folicacid，^97%);N，N，-二环己基碳二亚胺(DCC 99% ) ；DSPE-PEG-NH2；吡啶；二甲基亚砜；氯化钠；甲醇；Te粉(99 % ); NaBH4(AR级)；巯基丙酸(AR级)；CdCl2.2.5H20(AR级)；石油醚(AR级)；高纯N2;实验用水为电阻率大于18ΜΩ.cm的超纯水。
[0035]2.荧光量子点合成方法:
[0036]水溶性CdTe量子点的制备:取Te粉0.1276g(lmmol)，加入0.15723g NaBH4，加入5mL超纯水，通高纯犯反应得到无色的无氧NaHTe溶液，通犯保存备用，即得新鲜制备的碲氢化钠溶液。将0.4566g CdCl2.2.5H20溶于30mL蒸馏水中，加入350yL巯基丙酸，用0.1mol/LNaOH溶液调节pH值为12。用高纯犯将溶液在密闭体系中脱氧保护，在适当的搅拌速度下，向溶液中加入200yL新制备的无氧NaHTe溶液，将反应液加热至96°C回流lh，即得到尺度较为均一的CdTe纳米粒子溶液(绿色荧光)。
[0037]3.叶酸-聚乙二醇-二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺的合成方法:将62.5mg叶酸与1mLDMSO置于反应瓶中反应，加入250mg DSPE-PEG(2000)-NH2和250yL吡啶，在81.5mgDCC的催化下得到反应液，通过旋转蒸发除掉吡啶，再加入31.25mL超纯水通过透析、微孔滤膜过滤，最后冷冻干燥得到黄色叶酸脂质材料(Folate-PEG-DSPE)。
[0038]4.叶酸靶向荧光量子点脂质体纳米探针的制备方法:按照配比DPPC:胆固醇:mPEG(2000)-DSPE:Folate-PEG-DSPE = 75:20:4:1，总量为20mg，称取各脂质材料置于250mL茄形瓶中，经氯仿:甲醇=2:1混合有机溶剂溶解，通过旋转蒸发，形成一均匀薄膜，在真空干燥器中40°C干燥Ih，再加入绿色荧光量子点水溶液8mL水化，经Sepharose CL-4B凝胶分离，得到脂质体溶液后，通过脂质体挤压仪(10nm碳酸酯膜)挤压过膜3次即得叶酸靶向荧光量子点脂质体纳米探针。
[0039]实施三
[0040]1.仪器与试药
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