可溶性Fc受体的高度浓缩制剂的制作方法
【技术领域】
[00011本发明涉及可溶性Fe受体的新型制剂，特别涉及包含高浓度的可溶性Fe γ RIIB受 体的制剂。本发明进一步涉及所述制剂作为药物组合物在治疗自身免疫性疾病、感染、肿瘤 和其它与免疫系统相关的病症中的用途。
【背景技术】
[0002] 人可溶性Fe γ RIIB是一种在治疗特发性血小板减少性紫癜、系统性红斑狼疮和其 它自身免疫性疾病中具有前途的候选物质。人可溶性Fey RIIB是在过去10至15年中已经开 发的多种可溶性抗体受体中的一种。
[0003] WO 00/32767记载了可溶性Fe受体（SFcR)，其仅由受体的细胞外部分组成并且没 有被糖基化。由于这些蛋白没有跨膜结构域和信号肽，它们以可溶性形式存在并且不与细 胞结合，这往往是Fe受体(FcR)的情况。此外，WO 00/32767中记载了sFcR可以被重组产生， 由于它们能够与抗体的Fe部分相结合而不干扰免疫系统的其它组分，因此SFcR已被提议用 于治疗自身免疫性疾病。WO 00/32767还记载了某些sFcR的晶体结构，并记载了发现下述物 质的可能性:所述物质借助于这些晶体结构而抑制IgG与sFcR的相互作用。所述晶体结构的 阐明使得能够通过使用如可得到的计算机程序筛选数据库或计算机辅助药物设计，寻找出 这种抑制剂。
[0004] WO 03/043648中所限定的发明进一步阐述了WO 00/32767的发现，并提供了特别 针对疾病(例如多发性硬化(MS)、系统性红斑狼疮(SLE)和类风湿性关节炎(RA))以及具有 升高水平的自然杀伤(NK)细胞的疾病的治疗方法。虽然所述受体在原核生物中重组产生并 因此未被糖基化，WO 03/043648的发明人意外地发现，尽管预期非糖基化的蛋白的溶解度 不高，但所述受体可以以可溶性形式的sFc YR的高达50mg/ml的相对高的浓度被纯化。
[0005] WO 00/32767、W0 03/043648和其它出版物提出了FcR在免疫系统的防御反应中起 重要作用。当病原体进入血液循环后，它们被免疫球蛋白（也称为抗体)结合。由于对病原体 的免疫反应是多克隆的，大量抗体产生并与病原体结合，导致免疫复合物(IC)的形成。随后 IC被免疫系统专门的效应细胞(如吞噬细胞或巨噬细胞)吞噬，从而自血液循环中移除。胞 吞是由抗体的Fe-部分与在前述效应细胞上FcR的结合介导的，其中所述抗体的Fe-部分与 病原体一起形成1C。免疫系统的其它效应细胞，如自然杀伤细胞、嗜酸性粒细胞和肥大细胞 在其细胞表面也携带FeR，基于IC的结合，所述FcR释放支持免疫反应的储存介质如生长因 子或毒素。
[0006] 这些效应细胞的FcR也作为信号转导分子发挥作用，所述信号转导分子在体液免 疫反应过程中特异性地结合至多种同种型的免疫球蛋白。此外，在天然杀伤细胞上表达的 FcR在抗体包被的靶细胞的破坏中发挥基础性作用（"抗体依赖的细胞介导的细胞毒性"， ADCC)〇
[0007] 然而，在病原体防御中，除FcR的正面效应外，也会发生由于患者自身抗体的存在 而引起的过度反应，这种过度反应会导致免疫系统的不希望有的的刺激，这种刺激特别体 现为炎性疾病或自身免疫性疾病。这种针对机体自身物质的免疫反应仍是一个主要的医学 难题，并且尽管有许多治疗自身免疫反应的方法，但是这些方法在每一个患者中并非等效 的。
[0008] Fc γ R家族的所有成员（即对IgG型抗体具有特异性的FcR)都为完整的膜糖蛋白， 其具有与免疫球蛋白有关结构域的C2-组相关的胞外结构域，具有单一跨膜结构域和长度 可变的胞质内结构域。已知三种Fc γ受体形式，称为Fc γ RI(CD64)、Fc γ RII (CD32)和Fc γ RIIKCD16)。在本发明的优选实施方案中特别关注Fe γ RII(CD32)。
[0009] Fe YRII蛋白是仅结合IC中复合IgG的40KDa完整的膜糖蛋白。这些受体是最广泛 表达的Fe γ R，它们存在于所有造血细胞包括单核细胞、巨噬细胞、B细胞、NK细胞、嗜中性粒 细胞、肥大细胞和血小板上。存在三种人Fe γ RII基因 （Fe γ RII-a、Fc γ RII-b、Fc γ RII-C)， 这三种基因结合聚集体或免疫复合物中的IgG。
[0010] 炎症是一个自体白细胞对外源物质如细菌和病毒的感染进行反应的过程。炎症通 常表现为受影响的组织的疼痛、肿胀、发热和发红。被称为细胞因子的效应物和前列腺素控 制这一过程，且它们以有序且自限制的级联被释放至血液或受影响的组织。所述效应物的 释放增加了损伤或感染区的血流量。一些效应物会导致体液向组织中泄露，进而引发肿胀。 这一保护过程可能刺激神经并引起疼痛。当这些变化在相关区域中发生一段有限的时间， 其对身体是有益的。
[0011] 在自身免疫性疾病中，患者的免疫系统已经失去了识别自体（"自身"）和外源蛋白 的能力。因此，由于"自身"蛋白是持久产生并被识别为外源的，会产生这样的抗体:所述抗 体识别"自身"蛋白并形成免疫复合物，该免疫复合物持续激活免疫系统。这种慢性病症可 持续数年最终导致严重的器官损伤，且有可能导致患者的死亡。存在许多以多种方式影响 机体的不同的自身免疫性障碍。例如，患有多发性硬化症的个体的大脑受到影响、患有克罗 恩病(Crohn's disease)的个体的肠道受到影响，而患有类风湿性关节炎的个体的滑膜、骨 和各种关节软骨均受到影响。随着自身性免疫障碍发展，将会导致一种或多种类型的自身 组织损毁、器官的异常生长或器官功能的改变。自身免疫性障碍可能影响单一器官或组织 类型，或可能影响多个器官和组织。通常受到自身免疫性障碍影响的组织和器官包括红细 胞、血管、结缔组织、内分泌腺(如甲状腺或胰腺）、肌肉、关节和皮肤。
[0012]炎性障碍和/或自身免疫性障碍的实例包括但不限于，原发性免疫性血小板减少 症（ITP)、系统性红斑狼疮(SLE)、类风湿性关节炎(RA)、自身免疫性溶血性贫血(AIHA)、糖 尿病、寻常天疱疮(Pemphigus vulgaris)、桥本甲状腺炎（Hashimoto 's thyroiditis)、自 身免疫性内耳病、重症肌无力、恶性贫血、阿狄森氏病(Addison's disease)、皮肌炎、干燥 综合征（Sjogren ' s syndrome )、皮肌炎、多发性硬化症、莱特尔氏综合征（Re iter ' s syndrome)、格雷夫斯病(Graves disease)、自身免疫性肝炎、家族性腺瘤息肉病和溃疡性 结肠炎。
[0013]根据Fc γ R的功能是活化还是抑制可将其分为两大类。活化受体与具有共有序列 Υ-Χ2-Ι7Ι-Χ6-12-Υ-Χ2-Ι/1的细胞质的16个氨基酸的免疫受体酪氨酸基激活基序(ITAM)有关 (Barrow和Trowsdale ,EuJI，2006，36:1646-1653)。例如，可在Fc γ RIIA中发现该基序。另一 类FcR是抑制受体，该类受体在受体细胞质部分中含有具有共有序列S/I/V/L-X-Y-X 2-VV/ L的6个氨基酸的抑制基序（Ι??Μ) (Barrow和Trowsdale ,EuJI ,2006,36:1646-1653)。这类抑 制FcR的一个实例是Fe γ RIIB。
[0014] Fe γ RIIB(Fc γ RIIB)具有两个抑制活性。Fe γ RIIB的一个抑制活性是基于ITIM-基序的，该活性在Fe γ RIIB连接至ITAM携带受体（即Fe γ RIIA)时发生，从而导致对ITAM触 发的钙动员及细胞增殖的抑制。Fe γ RIIB的第二个抑制作用涉及受体的同源聚合(Fe γ RIIB成簇），该同源聚合将促凋亡信号传递至细胞质内。该促凋亡信号仅在B细胞中有报道， 并且可被Fe γ RIIB与B细胞受体（BCR)的连接所阻断（JV Ravetch，S. Bo lland ,Annu Rev.Immunol.2001;19:275-90)。
[0015] 如上所述，在WO 03/043648中已经公开了sFcy RIIB在药物制剂中的用途，其中如 注射至患者体内的合理体积的治疗溶液中可包含相对大量的Fe γ受体。由于可溶性Fe γ受 体可结合至抗体而不影响免疫系统的其它组成部分，因此可溶性Fe γ受体，尤其是Fe γ RIIB已经被建议用于自身免疫性疾病的治疗。因此，可溶性Fe受体能够中和血流中的抗体， 这尤其对自身免疫过程具有衰减作用。已经在WO 03/043648中提及的可能的启示包括用于 治疗多发性硬化症(MS)、系统性红斑狼疮(SLE)和类风湿性关节炎(RA)以及用于具有升高 水平的NK细胞的疾病的可溶性Fe γ受体，以避免之前对于所述疾病采用的疗法的副作用。
[0016] WO 03/043648的教导的重点在于所发现的这样的事实:可溶性Fe受体可用于形成 含有浓度高达50mg/ml的可溶性受体的水性溶液。对于某些用途而言，上述活性试剂的浓度 可满足需求。然而，近期的研究证明显著大于lmg/kg患者体重的治疗剂量的sFcR(如sFc γ RIIB)对成功治疗自身免疫性疾病是有益的，甚至是必需的。
[0017] 药物的皮下给药被认为是一种有效的、相对简单且不繁杂的向患者递送活性试剂 的方法。与需要更复杂医疗设备且多数情况下需要在医生办公室或诊所给药的静脉输注相 比，皮下给药可以简单地施用，甚至由患者本人完成。皮下给药还会导致延迟起效，即增长 的半衰期及达到最大浓度的时间。同时还发现，经皮下给药降低了最大血药浓度。上述这些 作用基于患者的皮下给药，活性试剂从该皮下位置转运至血流。通常认为大于约16_20kDa 的蛋白质主要被淋巴系统摄取，这对Fey R来说可能是一个优势，因为靶标B细胞群也在淋 巴系统中成熟并驻留（Porter,C.J.H.和Charman,S.A. (2000) ,J.Pharm Sci.89,297-310)。 [0018]然而，皮下给药途径每次施用的注射体积优选地限制为I .Oml至约1.5ml(Gatlin, L.A.和Gatlin,C.A.B,(1999),Gapta,P·K·&Brazeau,G·A·,eds·,Interpharm Press, Denver, pp .401-425)。因此认为WO 03/043648中的水性sFc γ R溶液不能用于皮下给药。相 反，根据这一文献的教导不得不预期，对于足够高浓度的受体，水性溶液中的受体会沉淀且 所述受体的不被希望大的晶体会形成，这相应会引起针的堵塞和/或在注射部位的疼痛。因 此，除去所有的预期的优点，皮下给药似乎不是一个有前途的治疗途径，而相反地，静脉注 射或输液似乎是唯一可行的递送方法。
【发明内容】
[0019 ]因此，本发明的一个目的是向患者提供复杂程度和负担较小的Fe受体的给药方法 和条件，以及提供可溶性Fe受体、尤其是可溶性Fe γ RIIB的水性制剂，该水性制剂含有足够 高浓度的受体从而使皮下治疗方案可用于自身免疫性疾病。
[0020]本发明的进一步目的是提供高度浓缩的可溶性Fe受体的此类水性制剂，该制剂为 随时可用(ready-to-use)的形式，其在常规药物储存条件下稳定超过24个月，或者，该制剂 为允许长期储存且在皮下施用之前允许简便、直接地调节和重构的形式。
[0021 ]根据本发明包含在水性缓冲溶液中的可溶性Fc受体(SFcR)的制剂可以达到上述 目的，其中所述Fc受体的浓度大于50mg/ml，且所述制剂包含生理上可接受的缓冲物质。
[0022] 在本发明的研究过程中，惊奇地发现，与之前的预期相反，可提供具有甚至高于 70mg/ml、优选地超过150mg/ml浓度的溶解于适宜缓冲溶液中的可溶性Fc受体，这也是第一 次可以采用上述浓度提供用于皮下给药的药物组合物形式的sFcR。作为肠胃外的给药形 式，皮下给药比静脉给药形式更简便且更易操作。如上文所述，即使患者本人也可实施皮下 给药。
[0023] 皮下给药需要一个短且通常细的套管。本发明的高度浓缩的制剂提供完全溶解的 且均质形式的sFcR，并且所述SFcR处于允许使用所述细套管的可接受的粘度，或者作为包 含足以通过所述细套管的小晶体的晶体悬浮液。因此，既显著增加患者的便利性又能实现 通过皮下途径的受体给药。
[0024] 如下文所述的本发明的制剂使提供可溶性FcR，尤其是提供浓度高至最大值的可 溶性Fe YRIIB成为可能，该最大值主要受由于Fc受体的高浓度而使溶液粘度增加的限制。 当选择合适的缓冲物质并调节适宜的渗透压(O smo la I i ty)时，在生理pH下的稳定的220mg/ ml或更高的sFc γ RIIB可包含在本发明的框架内。
[0025] 根据本发明所采用的生理上可接受的缓冲物质是适宜溶液的医药用途的常用缓 冲剂。然而，在本发明的框架内，发现基于使用的缓冲物质，溶液的PH值对Fc受体的溶解度 有很大影响。根据选择的缓冲剂，不得不将PH值调节在一个确定的范围内，特别是将pH值调 节至一个对于获得所需Fc受体溶解度的特定的最佳值，尤其是当目的为提供一种不含任何 晶体sFcR的制剂时。
[0026] 进一步发现，由于蛋白质中带