华蟾酥毒基和酯蟾毒配基在抑制肠道病毒71型感染中的新用图
【技术领域】
[0001] 本申请涉及华蟾酥毒基和酯蟾毒配基的新用途，具体地，涉及华蟾酥毒基和酯蟾 毒配基用于制备用于预防和治疗手足口病的药物的用途，尤其是用于制备抗肠道病毒71 型药物的用途。
【背景技术】
[0002] 手足口病是一种常见的急性病毒性儿童传染病，主要病原是肠道病毒71型 (Enterovirus 71，简称为 EV71)和柯萨奇病毒 A16 型（Coxsackievirus A16,简称为 CA16)， 其中EV71型引发的病症尤为严重。近年来，手足口病在亚太地区的频繁爆发已经成为了严 重的社会健康问题。据统计，我国从2008年至2012年，超过七百万例的手足口病被报道， 并导致了 2443例死亡。
[0003] 目前仍没有上市的疫苗来预防手足口病。在治疗方面，目前临床上常使用阿昔洛 韦、更昔洛韦、利巴韦林等常规抗病毒药物，并结合板蓝根、注射用双黄连、清开灵冲剂等。 虽然以上药物已经用于治疗手足口病，但是它们都属于广谱的清热解毒药物，直接作用机 制不明且针对性不强。仍缺乏专门针对EV71的特效治疗药物。
[0004] 虽然现在已经发现一些天然化合物，如：猫眼草黄素（chrysosplenetin)和垂 叶黄素（penduletin)等均表现出抗EV71活性，对于人横纹肌肉瘤细胞，猫眼草黄素的 IC5。（半数抑制浓度）为0. 20 μ M，垂叶黄素的IC5。为0. 37 μ M ;但是两者的细胞毒性均 较大，对于人横纹肌肉瘤细胞，猫眼草黄素的CC5。（细胞存活率为50 %时的药物浓度）为 13. 9 μ Μ，垂叶黄素的CC5。为74. 18 μ M(Zhu et al.，2011)。所以仍然需要开发针对EV71的 低细胞毒性特效治疗药物。
[0005] 华蟾酥毒基（cinobufagin)，化学式为C26H34O6，分子量为442. 54,其结构式如下：
[0007] 酯蟾毒配基（resibufogenin)，化学式为C24H32O 4，分子量为384,其结构式如下：
[0008]
[0009] 华蟾酥毒基和酯蟾毒配基是传统中药蟾酥中的活性成分，属于蟾蜍二烯羟酸内酯 类化合物。研究表明，华蟾酥毒基和酯蟾毒配基具有抗炎、强心、镇痛、抗癌的作用。另外， 华蟾酥毒基还可以抑制细胞内乙肝病毒（HBV)的复制。但是尚未报道过华蟾酥毒基和酯蟾 毒配基对肠道病毒71型的抗病毒作用。
【发明内容】
[0010] 发明人从天然产物单体库中筛选获得了两个蟾蜍二烯羟酸内酯类化合物--华 蟾酥毒基、酯蟾毒配基，并惊讶地发现华蟾酥毒基和酯蟾毒配基对肠道病毒71型造成的细 胞病变效应和空斑效应有抑制作用，对EV71病毒衣壳蛋白的合成有浓度依赖性地抑制作 用，而且对细胞的毒性较低，因此华蟾酥毒基和酯蟾毒配基可以成为抗手足口病病毒的候 选药物的先导化合物，可以用于预防或治疗手足口病。
[0011] 本发明提供了华蟾酥毒基在制备用于预防或治疗受试者中的手足口病的药物中 的用途。优选地，所述受试者是人。更优选地，所述受试者为16岁以下的儿童。最优选地， 所述受试者为5岁以下的儿童。
[0012] 优选地，所述预防或治疗手足口病的药物是抗肠道病毒71型的药物。
[0013] 优选地，所述药物包含活性成分华蟾酥毒基和一种或多种可药用载体。
[0014] 优选地，所述药物还可包含其他用于治疗手足口病的活性成分。
[0015] 本发明还提供了一种用华蟾酥毒基抑制由肠道病毒71型引起的细胞病变效应的 方法，所述方法包括使浓度为5-3000nM的华蟾酥毒基与细胞接触。
[0016] 优选地，华蟾酥毒基的浓度为10_250nM，更优选地，华蟾酥毒基的浓度为15-70 nM〇
[0017] 优选地，所述细胞是人细胞，更优选地，所述细胞是人横纹肌肉瘤细胞或稳定转染 肠道病毒71型受体hSCARB2的人横纹肌肉瘤细胞。
[0018] 本发明还提供了一种用华蟾酥毒基抑制由肠道病毒71型引起的空斑形成的方 法，所述方法包括使浓度为5-3000nM的华蟾酥毒基与细胞接触。
[0019] 优选地，华蟾酥毒基的浓度为10_500nM，更优选地，华蟾酥毒基的浓度为 15-125nM。
[0020] 优选地，所述细胞是人细胞，更优选地，所述细胞是人横纹肌肉瘤细胞或稳定转染 肠道病毒71型受体hSCARB2的人横纹肌肉瘤细胞。
[0021] 本发明提供了酯蟾毒配基在制备用于预防或治疗受试者中的手足口病的药物中 的用途。优选地，所述受试者是人。更优选地，所述受试者为16岁以下的儿童。最优选地， 所述受试者为5岁以下的儿童。
[0022] 优选地，所述预防或治疗手足口病的药物是抗肠道病毒71型的药物。
[0023] 优选地，所述药物包含活性成分酯蟾毒配基和一种或多种可药用载体。
[0024] 优选地，所述药物还可包含其他用于治疗手足口病的活性成分。
[0025] 本发明还提供了一种用酯蟾毒配基抑制由肠道病毒71型引起的细胞病变效应 的方法，所述方法包括使浓度为50-60000nM的酯蟾毒配基与细胞接触。
[0026] 优选地，酯蟾毒配基的浓度为98_12500nM，更优选地，酯蟾毒配基的浓度为 195-3000nM，最优选地，酯蟾毒配基的浓度为250-1500nM。
[0027] 优选地，所述细胞是人细胞，更优选地，所述细胞是人横纹肌肉瘤细胞或稳定转染 肠道病毒71型受体hSCARB2的人横纹肌肉瘤细胞。
[0028] 本发明还提供了一种用酯蟾毒配基抑制由肠道病毒71型引起的空斑形成的方 法，所述方法包括使浓度为50-3000nM的酯蟾毒配基与细胞接触。
[0029] 优选地，酯蟾毒配基的浓度为100-1500nM。
[0030] 优选地，所述细胞是人细胞，更优选地，所述细胞是人横纹肌肉瘤细胞或稳定转染 肠道病毒71型受体hSCARB2的人横纹肌肉瘤细胞。
[0031] 在本发明中由肠道病毒71型引起的细胞病变效应是指由肠道病毒71型病毒在宿 主细胞内大量增殖，导致细胞病变甚至死亡的效应。
[0032] 在本发明中由肠道病毒71型和/或柯萨奇病毒A16型引起的空斑形成是指肠道 病毒71型感染已形成致密单层状态的细胞群体时，经过一定培养时间使每个感染细胞周 围的细胞逐渐感染、死亡、脱落，形成肉眼可见的空斑。所述细胞是人细胞，更优选地，所述 细胞是人横纹肌肉瘤细胞或稳定转染肠道病毒71型受体hSCARB2的人横纹肌肉瘤细胞。
【具体实施方式】
[0033] 除非另外说明，实施例中使用的各种仪器和试剂均为普通市售品。
[0034] 实施例1 :构建RDS细胞
[0035] 将合成的两端有EcoR I&Xba I酶切位点的EV71/CA16受体hSCARB2基因片段 (NCBI登录号：NM_005506. 3,由上海捷瑞公司合成）插入慢病毒载体Lenti-X pLVX-Puro载 体（购自Clontech)，并使用慢病毒载体试剂盒中的转染试剂（购自Clontech)按说明书转 染人横纹肌肉瘤细胞（RD细胞，购自ATCC，登录号#CCL-136)，获得稳定转染hSCARB2的RD 细胞，简称RDS细胞（RDS细胞的具体构建方法参见Li et al. Virology Journal, 10:250)。
[0036] 实施例2 :华蟾酥毒基和酯蟾毒配基对细胞的细胞毒性以及对肠道病毒71型造成 的细胞病变效应的抑制作用
[0037] 取对数生长期的RD细胞和RDS细胞，分别以3 X IO4个/孔和6 X IO4个/孔的浓 度接入96孔培养板，培养24小时。RD细胞和RDS细胞均在37°C和5% CO2下培养，，其中 培养RD细胞使用的培养液为补充有10%胎牛血清的DMEM培养基（简称为10% FBS-DMEM， FBS (胎牛血清）和DMEM均购自Sigma)，培养RDS细胞使用的培养液为含有0. 5 μ g/ml嘌 呤霉素（购自 Clontech)的 10% FBS-DMEM。
[0038] 向各孔加入50μ L含不同浓度的华蟾酥毒基或酯蟾毒配基（购自中国药品生物制 品检定所）的DMEM细胞培养液（购自Sigma)，使华蟾酥毒基的终浓度为2000ηΜ，ΙΟΟΟηΜ， 500nM, 250nM, 125nM, 62. 50nM, 3L 25nM, 15. 62nM, 7· 81nM, 3· 91nM ;酯蟾毒配基的终浓度为 50000nM, 25000nM, 12500nM, 6250nM, 3125nM, 1563nM, 781nM, 391nM, 195nM, 98nM。每个浓度 设3个复孔，继续培养细胞48小时，用荧光细胞活性检测试剂盒（购自Promega公司）检 测细胞活性。操作按照试剂盒说明书进行，在多标记微孔板检测系统（Multilabel Plate Reader 2030,购自Perkin Elmer公司）上测定560nm下的荧光值，荧光值的大小反映细胞 的活性。
[0039] 在检测华蟾酥毒基和酯蟾毒配基对由EV71造成的细胞病变效应的抑制作用时， 加药的同时各孔加入50yL EV71病毒（EV71-C4b，获自吉林大学艾滋病疫苗国家工程实验 室，参见Li et al. Virology Journal, 10:250)进行感染（该病毒在RDS/RD细胞中的感染 复数为0. 008)，继续培养细胞48小时后，如上所述测定560nm下的荧光值。
[0040] 同时还设置了仅加入DMEM细胞培养液处理的细胞对照及仅加入EV71进行感染的 病毒对照，除了加入的物质不同以外，其他操作同上。
[0041] 细胞毒性用CC5。（细胞存活率为50%时的药物浓度）表示，细胞存活率=(给药 组荧光值/细胞对照组荧光值）X 100% ;
[0042] EV71细胞病变效应抑制率=[(感染EV71并给药组荧光值-感染EV71对照组荧 光值）/细胞对照组荧光值]X 100% ;根据不同浓度的华蟾酥毒基和酯蟾毒配基对每孔细 胞病变效应的抑制率分别算出抑制率为50%时的药物浓度，用半数抑制浓度IC 5。表示；
[0043] 药物抗EV71的效果以