神经干细胞在介导影响p25和p35蛋白表达中的应用
【技术领域】
[0001]本发明属于生物医药技术领域。更具体地，涉及神经干细胞在介导P25和P35蛋白表达从而促进缺血缺氧性脑病新生大鼠神经功能恢复方面的应用。
【背景技术】
[0002]围产期窒息所致缺氧缺血性脑病(hypoxic-1schemic encephalopathy，HIE)是一种常见的脑损伤疾病，该病是新生儿期危害最大的常见病之一，常引起新生儿死亡和严重神经系统发育障碍。据统计，我国新生儿HIE发生率约为活产儿的3%。?6%。，其中15%?20%在新生儿期死亡，存活者中20%?30%可能遗留不同程度的神经系统后遗症。另外，还有包括阿尔茨默氏病、肌萎缩侧索硬化症、帕金森病等各种神经变性疾病，已严重威胁人类的健康，
目前为止，针对脑损伤和神经系统变性性疾病，尚无有效的治疗手段。研究显示，P35和P25蛋白是细胞周期素依赖蛋白激酶5(Cdk5)的调节亚基，Cdk5在哺乳动物海马神经元的学习和记忆功能中发挥重要作用。生理状态下，CDk5在p35等调节亚基的信号作用下锚定于膜上，磷酸化膜性底物，通过平衡促凋亡和促存活信号转导通路，在神经元发育、迀移、神经元存活中发挥重要作用。也有研究显示，P35蛋白是大脑皮层中cdk5的特异性激活剂，能够被钙激活中性蛋白(calpain)分解为P25并与cdk5结合使之激活，参与神经细胞的歉意、分化、细胞凋亡和信号传导等过程。而Cdk5在多种人类神经退行性疾病中起非常重要的作用，可能是构成包括阿尔茨默氏病、肌萎缩侧索硬化症、帕金森病等神经变性疾病的主要分子病理基础。
[0003]因此，针对P35和P25蛋白的调控从而治疗相关的脑损伤和神经变性疾病，是一种探索脑类疾病治疗药物的新方向和有效途径。
【发明内容】
[0004]本发明要解决的技术问题是克服现有HIE等脑损伤或神经变性疾病治疗技术的缺陷和不足，提供一种能够针对调控P35和P25蛋白的表达，从而实现HIE等脑损伤或神经变性疾病治疗目的的药物。本发明研究显示，神经干细胞(neural stem cells，NSC)能够调控P25、P35蛋白的表达变化，具体是上调P35蛋白表达、下调P25蛋白表达，抑制Cdk5的过度激活，从而对脑损伤起到保护治疗作用，对缺血缺氧性脑病等疾病有显著的疗效。
[0005]本发明的目的是提供神经干细胞在制备P25和/或P35蛋白表达调控剂方面的应用。
[0006]本发明另一目的是提供神经干细胞在制备脑损伤或神经变性疾病治疗药物方面的应用。
[0007]本发明再一目的是提供神经干细胞在制备缺血缺氧性脑病治疗药物方面的应用。
[0008]本发明上述目的通过以下技术方案实现:
神经干细胞在制备P25和/或P35蛋白表达调控剂方面的应用。
[0009]具体地，是神经干细胞在制备P25蛋白表达抑制剂方面的应用，以及神经干细胞在制备P35蛋白表达促进剂方面的应用。
[0010]神经干细胞在制备脑损伤或神经变性疾病治疗药物方面的应用。
[0011]其中，所述脑损伤或神经变性疾病是指P25和/或P35蛋白参与调控的脑损伤或神经变性疾病。
[0012]更具体地，所述脑损伤或神经变性疾病是指缺血缺氧性脑病
另外，在针对缺血缺氧性脑病治疗药物时，所述药物是指能够保护和/或恢复脑缺血损伤的药物。
[0013]更进一步地，所述药物是指能够保护和/或恢复脑缺血损伤，且能够上调P35蛋白表达、下调P25蛋白表达的药物。
[0014]本发明为了探讨神经干细胞对P25、P35蛋白表达变化的影响，以及对缺血缺氧性脑病新生大鼠的治疗作用，选取了60只新生7天SD大鼠，按随机数表法分为3组:SHAM组(对照组):20只，按HIE模型制作过程施予假手术，不给予其他干预。HIE+PBS组(缺血组):20只，先制成HIE模型，然后给予I3BS作为安慰治疗;HIE+NSC组(治疗组)20只，先制成HIE模型，然后给予NSC治疗。分别于干预后第5、7、14、21天进行神经行为学检测(Rotarod Test旋转实验和Morris水迷宫测试)。21日后处死采用组织切片HE染色，观察新生大鼠脑损伤的病理变化。组织匀浆法提取海马蛋白，Western blot法检测海马区P35、P25蛋白的表达。
[0015]Rotarod Test结果显示造模后第5天模型组与治疗组大鼠在转轮中坚持时间明显下降，与对照组比较差异有统计学意义(P〈0.05);造模后第7、14、21天，模型组与治疗组大鼠在转轮中坚持时间明显升高，其中治疗组升高趋势明显高于缺血组(P〈0.05)，第21天模型组与治疗组大鼠在转轮中坚持时间比较差异有统计学意义(P〈0.0ShMorris水迷宫结果显示3大鼠的逃避潜伏期随训练天数增加而逐渐缩短，前5天的总体学习成绩的组间差异有统计学意义(P〈0.01)。第7天开始治疗组时间逐渐缩短，第21天治疗组与缺血组大鼠的逃避潜伏期在各个时间点的差异均有统计学意义(P〈0.05)。模型组大鼠出现海马区神经元水月中、核染色质结构不清、空泡形成等病理变化，而治疗组病理损伤明显减轻。Western blot结果显示与对照组相比缺血组P35表达减少，P25表达增加(P〈0.05)，而治疗组与缺血组相比较P35表达增多，P25表达减少(P〈0.05)。
[0016]综上所述，显示，神经干细胞(neural stem cells，NSC)能够调控P25、P35蛋白的表达变化，具体是上调P35蛋白表达、下调P25蛋白表达，抑制Cdk5的过度激活，从而对脑损伤起到保护治疗作用，可促进大鼠缺血脑损伤后神经功能恢复，对缺氧性脑病等疾病有显著的疗效。因此，上述应用均应在本发明的保护范围之内。
[0017]本发明具有以下有益效果:
本发明研究显示，神经干细胞(neural stem cells，NSC)能够调控P25、P35蛋白的表达变化，具体是上调P35蛋白表达、下调P25蛋白表达，抑制Cdk5的过度激活，从而对脑损伤起到保护治疗作用，对缺血缺氧性脑病等疾病有显著的疗效。
[0018]本发明为HIE等脑损伤或神经变性疾病的治疗提供了一种新的治疗途径和药物开发基础，给缺血缺氧性脑病等相关疾病患者带来新希望。
[0019]另外，本发明还为研究Cdk5在HIE脑损伤中的作用及神经干细胞的治疗机制提供了新思路，研究结果揭示了Cdk5在HIE脑损伤中发挥促凋亡作用，而神经干细胞可以阻断 Cdk5及其信号转导通路从而预防或减轻HEI脑损伤。
【附图说明】
[0020]图1为3组大鼠造模后不同时间点旋转试验检测结果。
[0021]图2为3组大鼠造模后不同时间点逃避潜伏期检测结果。
[0022]图3为3组大鼠造模后第21天海马脑片HE染色结果(200倍)。
[0023]图4为3组大鼠海马P35和P25蛋白表达电泳图。
[0024]图5为3组大鼠海马P35和P25蛋白定量表达分析结果(*表示P〈0.05)。
【具体实施方式】
[0025]以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备，以下实施例所用试剂和材料均为市购。
[0026]本发明实施例部分的统计学方法采用SPSS13.0统计软件处理。计量资料采用均数土标准差表示，各组间比较采用单因素方差分析，组间比较采用Student’s t-test进行检验。以P〈0.05为差异有统计学意义。
[0027]实施例1
1、实验动物及分组:
选择7日龄SD大鼠60只，雌雄各半，体重50-60g，由南方医科大学实验动物中心提供(SYXK(粵)2011-0074)，按随机数字表法分为3组:
(1)HIE+PBS组(缺血组):20只，HIE造模成功后PBS作为安慰治疗；
(2)SHAM组(对照组)；20只，仅按HIE模型制作过程施予假手术，不给予其他干预；
(3)HIE+NSC组(治疗组):20只，HIE造模成功后给予NSC治疗。
[0028]2、主要仪器设备与试剂
(I)主要仪器:转棒仪(Rotarod，济南益延科技发展有限公司，YLS-4C);RD1101-MWM-G鼠博士 MORRIS水迷宫视频分析系统(上海移数信息科技有限公司)；海力孚HF-240全自动生化分析仪;立体定位仪(深圳市瑞沃德生命科技有限公司，68000型);微量注射栗(深圳市瑞沃德生命科技有限公司，KdSientific 310);倒置相差显微镜(日本Olympus公司，CX31);电泳仪(瑞典Amersham公司；Ettan DALTsix)；低温离心机/凝胶图像分析仪(美国安莱公司，AlphaEmager2200)。
[0029](2)主要试剂:蛋白酶抑制齐Ij cocktail购自美国sigma公司；PVDF膜购自美国Millipore公司。P25/P35(C-19)多克隆抗体购自美国Cell Signaling公司；β-actin购自威佳公司；辣根过氧化物酶标记二抗购自中杉金桥公司;Westernblot化学发光检测试剂盒购自凯基生物公司；神经干细胞由广东省脐带血造血干细胞库提供，移植时PBS洗涤细胞3次，终浓度调节为