重组伪狂犬病病毒疫苗耐热冻干保护剂及其制备方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及疫苗耐热冻干保护剂及其制备方法，具体涉及重组伪狂犬病病毒疫苗 耐热冻干保护剂及其制备方法。
【背景技术】
[0002] 伪狂犬病病毒(PRV)又称猪疱疹病毒I型，是引起猪繁殖障碍的主要病原之一。PRV 基因组庞大，含有多个可缺失的病毒增殖非必须的基因，可供外源基因插入，插入外源基因 的重组病毒在增殖的同时可稳定表达外源基因，从而提供对伪狂犬病病毒和其他相应传染 病的抵抗力，因而其可作为重组病毒载体应用于重组疫苗的研制。重组伪狂犬病病毒的研 究主要涉及猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪圆环II型病毒(PCV2)、猪细小病毒(PPV)、 猪瘟病毒（CSFV)、口蹄疫病毒(FMDV)等，如保藏在中国典型培养物培养中心、保藏号为： CCTCC-V201408的重组伪狂犬病毒，是一种PCV2-PRV重组病毒，可用于制备PCV2-PRV二联基 因工程疫苗。
[0003] 现有的疫苗中，弱毒活疫苗是预防畜禽传染病的主要疫苗之一，在我国动物用疫 苗中活疫苗占相当大的比例。将活疫苗进行冻干保存，为疫苗的运输、保存和使用提供了很 多的方便。冻干保护剂是冻干活疫苗生产工艺中的一项关键技术，对疫苗的保存、运输和使 用均产生影响。目前国内常规的保护剂主要为脱脂牛奶、蔗糖、明胶等组分，组方简单，但热 稳定性和保护功能差，保存时间较短，在2°C_8°C条件下，保存期只有3-6个月，且多需要在-15°C以下保存，使疫苗的长期保存和长途运输受到很大限制。中国专利CN102727904A公开 了一种高致病性猪繁殖与呼吸综合征-伪狂犬病二联活疫苗耐热保护剂，该活疫苗耐热保 护剂按重量百分比计由明胶0.8~1.2%、大豆蛋白胨4~6%、甘氨酸0.5~1.5%、蔗糖3~5%、海藻 糖2~3%、聚乙烯吡咯酮1~2%、甘露醇0.5~1%、维生素E0.1~0.2%和注射用水通过高温灭菌、微 孔滤膜过滤除菌、混合步骤制备，具有良好的保护功能，但其成分中含有明胶，明胶是疫苗 内毒素的主要来源，易导致接种的动物产生发热反应。现有的疫苗耐热冻干保护剂多保护 性能不理想，或含有明胶或血清白蛋白、胰蛋白胨等动物源性成分，可能会对疫苗造成安全 性的影响。因此，研制一种耐热稳定性好、保护功能强、安全性高的活疫苗耐热冻干保护剂 显得尤为重要。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的在于克服现有技术中的缺陷，提供具有良好保护性能，能较长时间 保存重组伪狂犬病病毒疫苗且不含明胶和动物源性成分的耐热冻干保护剂。此外，本发明 还提供该耐热冻干保护剂的制备方法。
[0005] 为解决上述问题，本发明所采用的技术方案如下： 重组伪狂犬病病毒疫苗耐热冻干保护剂，其由按照重量百分数计的如下组分制成:海 藻糖4-8%、蔗糖0-3%、山梨醇0.2-0.8%、聚乙烯吡咯烷酮K-30 1-3%、大豆分离蛋白4-7%、小 麦蛋白酶解物〇. 5-1%，余量为注射用水。
[0006] 优选地，所述的重组伪狂犬病病毒疫苗耐热冻干保护剂由按照重量百分数计的如 下组分制成:海藻糖5%、蔗糖1%、山梨醇0.6%、聚乙烯吡咯烷酮K-30 1.5%、大豆分离蛋白5%、 小麦蛋白酶解物〇. 8%，余量为注射用水。
[0007] 相应地，本发明还提供所述重组伪狂犬病病毒疫苗耐热冻干保护剂的制备方法， 其包括如下步骤： 51、 制备小麦蛋白酶解物； 52、 取海藻糖、蔗糖、聚乙烯吡咯烷酮K-30和山梨醇，然后溶于注射用水总量3/5-4/5的 注射用水中，110-120 °C的温度下进行灭菌处理10_20min，得到溶液A; 53、 取大豆分离蛋白和步骤S1制得的小麦蛋白酶解物，溶于剩余部分的注射用水中，然 后用孔径为〇. 18-0.24mi的滤膜过滤除菌，得到溶液B; 54、 将步骤S2制得的溶液A与步骤S3制得的溶液B混合，即得本发明重组伪狂犬病病毒 疫苗耐热冻干保护剂。
[0008] 优选地，步骤S1所述小麦蛋白酶解物的制备方法包括如下步骤:取小麦蛋白粉，加 入其重量15~20倍量纯化水，搅拌均匀，混悬液中加入8~10m 〇l/L HCL调节溶液pH值为2.0~ 4 ? 0，加入1200~1800U/g的酶，35~45°C下酶解6~10h，用1~2mol/L HCL或NaOH保持溶液pH值 不变，酶解结束后95°C灭酶15~20min，冷却后离心取上清液，减压浓缩，减压干燥，即得小麦 蛋白酶解物。
[0009] 优选地，所述的酶解小麦蛋白的酶选自胃蛋白酶、胰蛋白酶、酸性蛋白酶和木瓜蛋 白酶中的一种或多种。优选地，所述的酶解小麦蛋白的酶为胃蛋白酶。
[0010] 优选地，所述步骤S2中，在115°C的温度下进行灭菌处理15min。
[0011] 优选地，所述步骤S3中，滤膜孔径为0.22mi。
[0012] 与现有技术相比，本发明的有益效果是： 1)本发明耐热保护剂不含明胶和动物源性成分，避免了疫苗内毒素的产生和血清蛋白 质潜在的血源性病原体污染疫苗带来的风险，提高了疫苗的安全性;2)本发明的耐热保护 剂保护性能好，冻干前后重组病毒的损失率不超过〇. 3个滴度； 3) 应用本发明耐热保护剂的重组伪狂犬病病毒活疫苗耐老化程度高，在37°C条件下存 放21天后，物理性状良好，每瓶疫苗的病毒滴度仅下降0.1-0.2个滴度，2°C_8°C可存放24个 月，每瓶疫苗病毒含量无明显下降，说明本发明耐热保护剂能有效提高疫苗的保存期，解决 了常规保护剂活疫苗需冷冻运输、储存不便等问题； 4) 本发明的耐热保护剂在保证耐热性能好、能有效保护活疫苗的前提下，还具有成本 低、制备方法简单、可实现大量生产等优点。
【具体实施方式】
[0013] 下面结合【具体实施方式】对本发明进行详细说明。
[0014] 实施例1本发明重组伪狂犬病病毒疫苗耐热冻干保护剂 重组伪狂犬病病毒疫苗耐热冻干保护剂，其由按照重量百分数计的如下组分制成:海 藻糖7%、蔗糖1%、山梨醇0.6%、聚乙烯吡咯烷酮K-30 1%、大豆分离蛋白6%、小麦蛋白酶解物 0.7%，余量为注射用水。
[0015]制备方法： s 1、取小麦蛋白粉，加入其重量15倍量纯化水，搅拌均匀，混悬液中加入1 Omo 1 /L HCL调 节溶液pH值为3.0，加入1800U/g的酸性蛋白酶，40 °C下酶解8h，用2mol/L HCL或NaOH保持溶 液pH值不变，酶解结束后95 °C灭酶20min，冷却后离心取上清液，减压浓缩，减压干燥，即得 小麦蛋白酶解物； 52、 取海藻糖、蔗糖、聚乙烯吡咯烷酮K-30和山梨醇，然后溶于注射用水总量3/5的注射 用水中，118°C的温度下进行灭菌处理12min，得到溶液A; 53、 取大豆分离蛋白和步骤S1制得的小麦蛋白酶解物，溶于剩余部分的注射用水中，然 后用孔径为〇. 22mi的滤膜过滤除菌，得到溶液B; 54、 将步骤S2制得的溶液A与步骤S3制得的溶液B混合，即得本发明实施例1重组伪狂犬 病病毒疫苗耐热冻干保护剂。
[0016]实施例2本发明重组伪狂犬病病毒疫苗耐热冻干保护剂 重组伪狂犬病病毒疫苗耐热冻干保护剂，其由按照重量百分数计的如下组分制成:海 藻糖5%、蔗糖1%、山梨醇0.6%、聚乙烯吡咯烷酮K-30 1.5%、大豆分离蛋白5%、小麦蛋白酶解 物0.8%，余量为注射用水。
[0017]制备方法： 51、 取小麦蛋白粉，加入其重量15倍量纯化水，搅拌均匀，混悬液中加入8mol/L HCL调 节溶液pH值为2.0，加入1200U/g的胃蛋白酶，42°C下酶解10h，用lmol/L HCL或NaOH保持溶 液pH值不变，酶解结束后95 °C灭酶20min，冷却后离心取上清液，减压浓缩，减压干燥，即得 小麦蛋白酶解物； 52、 取海藻糖、蔗糖、聚乙烯吡咯烷酮K-30和山梨醇，然后溶于注射用水总量4/5的注射 用水中，115°C的温度下