一种miRNA的组合制备抗非小细胞肺癌药物中的应用
【技术领域】
[0001]本发明属于基因工程领域，特别涉及非小细胞肺癌肿瘤相关成纤维细胞向正常成纤维细胞转化方法的构建以及在抗肿瘤治疗中的应用
【背景技术】
[0002]成纤维细胞是人的组织和肿瘤的关键细胞成分，可以分为静息和活化的成纤维细胞。例如，所述成纤维细胞在伤口愈合部位能被高度的激活。活化的成纤维细胞侵入病变部位并产生细胞外基质(ExtraceIlular matrixc,ECM)，充当一个其他细胞的支架。一旦伤口修复，活化的成纤维细胞恢复到静息的表型，这被称为正常成纤维细胞(Norma IFibroblasts,NFs) ο目前认为:肿瘤的发展不仅仅是由恶性癌细胞决定，也需要通过活化的肿瘤成纤维细胞或肿瘤相关成纤维细胞(Carc1-noma-associated-f ibroblast ,CAFs)的参与。正常成纤维细胞(Normal Fibroblasts ,NFs)与肿瘤相关成纤维细胞(Care1-noma-associated_fibroblast，CAFs)在形态学上差异不大，但是功能上确相差迥异，肿瘤相关成纤维细胞(CAFs)可以通过分泌多种细胞因子，趋化因子和细胞外基质促进肿瘤细胞增殖和进展。生长因子，例如，血管内皮生长因子(VEGF)，转化生长因子(TGF)和成纤维细胞生长因子2(FGF2)，都具有促进肿瘤细胞长生的功能，而正常成纤维细胞(Normal FibroblastsNFs)确没有以上功能。因此如果能找到一种促进肿瘤相关成纤维细胞(CAFs)向正常成纤维细胞(Normal Fibroblasts NFs)转化的方法，则可以使肿瘤细胞失去生长需要的各类细胞因子的支持，从而从另一途径起到抗肿瘤的作用。目前无论是抗肿瘤药物还是抗肿瘤治疗的方法多数是针对肿瘤细胞本身的，而针对肿瘤相关成纤维细胞(CAFs)的治疗药物和方法基本是空白。本发明将从通过一种新的方法促进肿瘤相关成纤维细胞(CAFs)向正常成纤维细胞(Normal Fibroblasts NFs)转化从而在非小细胞肺癌中起到抗肿瘤的作用。
[0003]微RNA(miRNA)是一类小的非编码RNA，在各种生理和病理过程中发挥重要的调节作用。越来越多的证据表明miRNA的不仅在癌细胞形成中过程中发挥作用，而且在成纤维细胞的转化及活化中起到调节作用。例如，miR-31，miR-214和miR-155重编程会促进卵巢癌的NF向CAF的转化。上调胃癌的CAF中miR_106b的表达水平可以促进胃癌细胞迀移和侵袭。miR-21被发现在大肠癌的CAF显著上调而后者有助于促进大肠癌的生长和侵袭。然而，在肺癌中，miRNA如何参与正常成纤维细胞(NFs)向肿瘤相关成纤维细胞(CAFs)的转化仍然不清
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[0004]根据世界卫生组织(WHO)公布的资料显示，肺癌是最常见的恶性肿瘤之一，列男性常见恶性肿瘤的第一位，列女性常见恶性肿瘤的第2、3位。非小细胞肺癌占所有肺癌的80%，三分之二以上的肺癌患者在诊断时已发生转移，往往失去手术机会，而针对肺癌的化疗药物效果亦欠佳，患者容易产生耐药，五年生存率低于5%，亟需寻找新的、有效的治疗肺癌的方法。以往研究往往集中于抗肿瘤细胞本身，越来越多的研究发现，肿瘤微环境在肿瘤形成是也发挥重要的作用。发明人发现通过改变1^1?-1，1^1?-206和1^1?-31的表达水平可以促进促进肺非小细胞肺癌的肿瘤相关成纤维细胞向正常成纤维细胞的转化，同样可以起到抗肿瘤的作用。这种新方法的制备在治疗非小细胞肺癌方面具有很好应用前景。
【发明内容】
[0005]发明目的
[0006]本发明的目的是提供全新的非小细胞肺癌肿瘤相关成纤维细胞向正常成纤维细胞转化的构建方法应用于非小细胞肺癌的抗肿瘤治疗
[0007]一种miRNA的组合物，其特征在于所述组合物包括pre-miR-l，pre-miR-206和ant1-miR-310
[0008]所述的一种miRNA的组合物，其特征在于所述的组合在制备以促进肺非小细胞肺癌的肿瘤相关成纤维细胞向正常成纤维细胞的转化药物中的应用。
[0009]所述的一种miRNA的组合物，其特征在于所述的组合物在制备治疗抗肿瘤药物中的应用。
[0010]本发明所述的肿瘤，可以为肺癌(包括非小细胞肺癌和小细胞肺癌)，肝癌，肠癌，胃癌，白血病，乳腺癌，神经胶质瘤，淋巴癌等癌症。尤其对非小细胞肺癌有效。
[0011]pre-miR-1 的序列:
[0012]UGGGAAACAUACUUCUUUAUAUGCCCAUAUGGACCUGCUAAGCUAUGGAAUGUAAAGAAGUAUGUAUCUCA，见SEQ Ν0:1ο
[0013]pre-miR-206的序列:
[0014]
UGCUUCCCGAGGCCACAUGCUUCUUUAUAUCCCCAUAUGGAUUACUUUGCUAUGGAAUGUAAGGAAGUGUGUGGUUUCGGCAAGUG，见SEQ NO:2。
[0015]ant1-miR-31 的序列:GCTATGCCAGCATCTTGCC，见SEQ N0:3。
[0016]具体来说:
[0017]1、应用miRNA芯片技术检测非小细胞肺癌患者肿瘤相关成纤维细胞(CAFs)及配对的正常成纤维细胞(NFs)中miRNA表达水平发现:与NFs相比较，CAFs中miR-l/miR-206的下调最为明显;miR-31的上调最为明显。利用lipofecmine-2000(购自invitrogen公司)共转染pre-miR-l，pre-miR-206和ant1-miR-31到肿瘤相关成纤维细胞(CAFs)中，可以促进其向正常成纤维细胞(NFs)的转化:即转染后的细胞通过与肺癌细胞共培养后可显著的抑制肺癌细胞侵袭和克隆形成能力，并在动物模型上起到抗肿瘤作用。
[0018]2、本发明米用pre-miR-l ,pre-miR-SC^ant1-miR-SHtSmiR-l，miR-206前导序列和miR-31干扰序列，产生预期效果。事实上，其他有关miR-1，miR-206前导序列和miR-31干扰序列组合物，也同样可以实现本发明效果。本发明并保护范围并不拘泥于上述组合物范围，同时也保护有关于miR-1，miR-206和miR-31组合物其他相应的序列。
[0019]有益效果
[0020]1.通过改变一组miRNA的表达水平促进肺非小细胞肺癌的肿瘤相关成纤维细胞向正常成纤维细胞的转化。这一组miRNA全新的组合是:miR-l，miR-206和miR-31。通过在肺非小细胞肺癌的肿瘤相关成纤维细胞中同时过表达miR-l/miR-206,低表达miR-31可以促进其向正常成纤维细胞的转化，从而在细胞和动物水平起到抗肿瘤的作用，具有潜在的抗非小细胞肺癌的应用价值
[0021]2.目前较为常用的抗肿瘤治疗均针对于肿瘤细胞本身，本发明通过促进肿瘤成纤维细胞的正常化起到抗肿瘤的作用，是治疗肿瘤的新方法。
【附图说明】
[0022]图1:基因芯片分析3例非小细胞肺癌患者肿瘤相关成纤维细胞(CAF)及配对的正常成纤维细胞(NF)中miRNA表达水平，红色表达表达上调，蓝色表示表达下降。
[0023]图2:15对非小细胞肺癌患者肿瘤相关成纤维细胞(CAF)及配对的正常成纤维细胞(NF)中miR-1, miR-206和miR-31的表达水平，U6设为内参。
[0024]图3:Transwel I 方法检测转染 pre-miR-l，pre-miR-206 和ant1-miR-31 到肿瘤相关成纤维细胞(CAF)中对A549及H460细胞细胞侵袭和转移能力影响。*p〈0.05
[0025]图4:克隆形成实验检测转染pre-miR-l，pre-miR-206和ant1-miR-31到肿瘤相关成纤维细胞(CAF)中对A549及H460细胞细胞克隆形成能力的影响。*p〈0.05
[0026]图5:4-5周龄裸鼠随机分5组分别种植:4549，4549+04?8或者4549+0六?8-了]\1，21天后裸鼠移植瘤的重量。CAFs-TM表示:pre-miR-l，pre-miR-206和ant1-miR-31到肿瘤相关成纤维细胞(CAF) o*p<0.05，**p〈0.01
[0027]图6:4-5周龄裸鼠随机分5组分别种植:4549，4549+04?8或者4549+0六?8-了]\1，肺转移瘤的HE染色。CAFs-TM表示:共转染pre-miR-l，pre-miR-206和ant1-miR-31到肿瘤相关成纤维细胞(CAF) o*p<0.05，**p〈0.01
[0028]图7:4-5周龄裸鼠随机分3组分别种植:4549，4549+04?8或者4549+0六?8-了]\1后肺转移指数的变化。CAFs-TM表示:pre-miR-l，pre-miR-206和ant1-miR-31到肿瘤相关成纤维细胞(CAF)。肺转移指数=肺转移肿瘤的数量/皮下原发肿瘤的重量。
【具体实施方式】
[0029]以下通过实施例对本发明作进一步的阐述，但不限制本发明。
[0030]一般性说明:
[0031 ]实施例中末注明具体条件的的实验方法，基本上都按照Sambrook，J等人编著的《分子克隆实验指南(第3版)》(Molecular Cloning:A Laboratory Manual ,3rd ed.黄培堂等译，科学出版社.2002.8)中所述的条件及方法或按照材料提供商所建议的条件及方法进行，其它没有详细描述的技术相应于本领域人员来说是熟知的标准方法。
[0032]本发明的材料:本申请中提及的细胞株、脂质体以及培养基均有商品供应或以别的途径能为公众所得，它们仅作举例，对本发明不是唯一的，可分别用其它适合的工具和生物材料来代替。
[0033]pre-miR-l 的制备方法:1.pre-miR-l序列(pUC57-Simple-pre-miR-l)由南京凯基生物科技发展有限公司合成。目的载体pYr-mir30-shRNA-2购自长沙赢润生物技术有限公司；2.将pre-miR-l片段克隆至pYr-mir30-shRNA-2载体上;3.将克隆进行测序确认;4.质粒提取。
[0034]pre-miR-206 的制备方法同pre-miR-l。
[0035]ant1-miR-31是通过人工合成的miR-31阻遏物，起到抑制内源性成熟miR-31表达的效应)，利用lipofecmine-2000 (贝勾自 invitrogen公司 M_pre-miR-l, pre-miR-206和ant1-miR-31共同转染入A549和H460细胞中，起到同时上调miR-1，miR-206和下调miR31表达的作用。
[0036]实施例1
[0037]—.非小细胞肺癌肿瘤相关成纤维细胞与正常成