一种与家蚕细胞凋亡相关的miRNA在抗病毒感染中的应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及细胞生物学技术领域，尤其涉及一种与家蚕细胞凋亡相关的miRNA在 抗病毒感染中的应用。
【背景技术】
[0002] 家蚕(Bombyx mori)是世界上重要的经济昆虫。我国是全球最大的蚕苗、蚕丝生产 国和茧丝绸出口国（顾国达等，2002)。蚕桑业在农业经济中占有重要地位，是农民收入的重 要来源。此外，家蚕作为生物反应器用来表达、生产外源基因具有其特有的优势(张耀洲等， 2008)。然而，蚕病的发生与流行严重影响着我国蚕桑产业的可持续发展。
[0003] 其中，家香核型多角体病毒（B.mori nuclear polyhedrosis virus，BmNPV，一种 杆状病毒）引起的蚕脓病作为危害最为严重的一种病毒病，在世界养蚕国家常有暴发，且传 染强、难控制，并极易造成巨大的经济损失。
[0004] 目前，我国四川、浙江、江苏和广东等蚕业主产区，每年由BmNPV引起蚕茧损失，约 占蚕病总损失的70~80 %。长期以来，尽管在家蚕抗病毒机理研究和抗性品种培育等方面 己取得进展，但仍有较多问题尚未解决（吕鸿声，2008)。而且，家蚕生物反应器亦存在着寄 主范围窄、特异性高和外源基因可能与家蚕体内对BmNPV调控机制的互作而出现基因沉默 现象等问题，严重制约利用家蚕生物反应器产业化开发有用蛋白的生物农场发展。
[0005] 研究表明，杆状病毒感染能诱导寄主昆虫细胞凋亡(Apoptosis)(庞义等，1998)， 而细胞凋亡则被认为是昆虫防卫病毒侵染的一种重要机制，主要通过寄主细胞的自杀性死 亡以限制病毒的感染与复制（Schultz等，2009 ;Vandergaast等，2011)。在寄主细胞中存在 多种凋亡调控蛋白如凋亡抑制蛋白（Inhibitors of apoptosis proteins，IAPs) (Verhagen等，2001)和API5(Apoptosis inhibitor-5)(Morris等，2006)等，可调节细胞凋 亡的发生与终止。事实上，IAPs最早是在昆虫病毒中发现的，可阻止寄主细胞凋亡而实现病 毒复制与增殖(Clem等，2007; Sahdev等，2010)。因此，在病毒侵染早期，通过促进感染病毒 的寄主细胞发生凋亡是有效的抗病毒策略之一。
[0006] 小RNA(microRNAs，简写miRNA或miR)是一类长度在18~25个碱基的具有调控作用 的非编码RNA核酸分子。小RNA在基因的转录后调控中起着重要作用，参与昆虫发育、生殖、 神经发生、代谢、免疫及细胞凋亡等各种生物过程。
[0007] 研究表明，小RNA亦能参与对病毒侵染免疫反应的调控过程(Fullaondo等，2012; Hussain等，2014)。目前，已在家蚕体内发现487条小RNA前体和563条成熟的小RNA(miRBase ￥21，2014)。其中，1^〇1111?-3378最早于2010年由031￥1-]^1等人采用501^0测序技术在家 蚕全虫和丝腺中鉴定获得，经预测发现有43个潜在靶基因，主要涉及胚胎发育、细胞分裂、 囊泡运输和神经受体以及肿瘤发生、病原微生物感染等，但bmo-miR-3378在家蚕体内的功 能与作用机制至今未有任何报道。
【发明内容】
[0008] 本发明发现家蚕microRNAs中的bmo-miR-3378能够促进家蚕细胞的凋亡，并通过 家蚕细胞的凋亡来抑制家蚕细胞中杆状病毒的增殖，从而实现对感染杆状病毒的家蚕的防 治。
[0009] 本发明发现了bmo-miR-3378在促进家蚕细胞凋亡中的应用。
[0010] 具体地，所述的家蚕细胞为家蚕BmN细胞。
[0011] 本发明发现了bmo-miR-3378在制备抗家蚕杆状病毒感染药物中的应用。
[0012] 作为优选，所述杆状病毒为核型多角体病毒。
[0013] 本发明提供了 bmo-miR-3378类似物在促进家蚕细胞凋亡中的应用，其特征在于， 所述bmo-miR-3378类似物为双链RNA序列，核苷酸序列如SEQ ID N0.9和SEQ ID N0.10所 不。
[0014] 本发明提供了 bmo-miR-3378类似物在制备抗家蚕杆状病毒感染的药物中的应用， 所述bmo-miR-3378类似物为双链RNA序列，核苷酸序列如SEQ ID N0.9和SEQ ID N0.10所 不。
[0015] 本发明提供了 bmo-miR-3378抑制物在抑制家蚕细胞凋亡中的应用，所述bmo-miR-3378 抑制物的核苷酸序列如 SEQ ID NO. 13 所示。
[0016]本发明还提供了 bmo-miR-3378抑制物在家蚕生物反应器中促进重组杆状病毒增 殖与侵染的应用，所述bmo-miR-3378抑制物的核苷酸序列如SEQ ID N0.13所示。
[0017]本发明还提供了一种家蚕杆状病毒病的防治方法，包括:采用bmo-miR-3378或其 类似物转染受杆状病毒感染的家蚕细胞;所述bmo-miR-3378的核苷酸序列如SEQ ID NO. 1 所示;所述类似物的为双链RNA序列，核苷酸序列如SEQ ID NO.9和SEQ ID NO. 10所示。 [0018] 为了验证上述发现，本发明采用qRT-PCR法明确家蚕BmN细胞感染BmNPV以及转染 bmo-miR-3378类似物与抑制物后bmo-miR-3378表达量的变化，然后分别采用Caspase活性 检测法、MTT法、qRT-PCR法和Reed-Muench终点稀释法研究了bmo-miR-3378表达量变化对感 染BmNPV的家蚕BmN细胞凋亡与活力、以及BmNPV复制与致病力的影响。结果表明，bmo-mi R-3378可通过促进BmN细胞凋亡而抑制BmNPV增殖和侵染。
[0019] 具体内容如下：
[0020] 本发明采用茎环法设计、合成bmo-miR-3378特异性PCR引物，并采用qRT-PCR法检 测比较了家蚕BmN细胞感染BmNPV后bmo-miR-3378的表达量变化。结果发现，在家蚕BmN细胞 感染BmNPV后12h和24h，bm〇-miR-3378表达量出现显著降低(p〈0.05)。
[0021 ]随后，发明人合成bmo-miR-3378类似物与抑制物，分别转染家蚕BmN细胞，并采用 qRT-PCR法检测bmo-miR-3378的表达水平。结果发现，家蚕BmN细胞转染bmo-miR-3378类似 物后，bmo-miR-3378表达量极显著升高(p〈0.05);而转染bmo-miR-3378抑制物后的表达量 极显著降低(p〈〇.〇l)。
[0022]在此基础上，发明人对分别转染bmo-miR-3378类似物与抑制物的家蚕BmN细胞进 行病毒感染处理，采用Caspase活性检测法测定BmN细胞的凋亡诱导情况。结果发现，经bmo-miR-3378 类似物处理的 BmN 细胞在接毒 24h 之内 ，细胞凋亡水平显著增高 （p〈0. 05); 而经 bmo-miR-3378抑制物处理的BmN细胞在接毒48h之内，细胞凋亡水平显著降低(p〈0.05)。这 表明bmo-miR-3378表达量升高或降低可分别显著诱导或抑制寄主细胞对病毒的凋亡反应。 [0023] 最后，本发明应用bmo-miR-3378类似物与抑制物处理家蚕BmN细胞，然后分别采用 MTT法评价BmN细胞活力、采用qRT-PCR法评价BmNPV在处理细胞中的增殖力和采用Reed-Muench终点稀释法评价处理细胞中BmNPV的感染力等。结果表明，经bmo-miR-3378类似物处 理的BmN细胞感染BmNPV后：细胞活力明显降低，且在接毒24h以后差异达到显著水平（p〈 〇. 05);细胞中的BmNPV的DNA拷贝数在接毒72h内均显著降低(p〈0.05); BmNPV的滴度亦显著 降低(p〈0.05)。与此对应，经bmo-miR-3378抑制物处理的BmN细感染BmNPV后，相关的指标均 呈现相反变化。
[0024] 上述结果表明，bmo-miR-3378可通过调控寄主细胞凋亡而影响病毒的复制与侵 染。因此，bmo-miR-3378可作为双向调控分子而应用于促进或抑制病毒在寄主细胞中的侵 染与增殖。
[0025]与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
[0026] 本发明发现bmo-miR-3378在家蚕BmN细胞感染BmNPV的过程中表达量显著降低，说 明其在病毒与寄主互作中的具有特定的功能;并通过实验证明bmo-miR-3378能够通过调控 BmN细胞的凋亡，进而影响病毒的增殖与侵染，其可以作为调控杆状病毒感染的新的小RNA， 对当前蚕业生产中的家蚕抗病毒防治与育种以及促进家蚕生物反应器产业化发展具有重 要的现实意义。
【附图说明】
[0027] 图1为BmNPV感染对家蚕BmN细胞中bmo-miR-3378表达量影响的qRT-PCR检测结果 示意图。图中结果表明，家蚕细胞在感染病毒早期(24h内），bm〇-miR-3378表达量出现显著 降低(p〈0.05)。
[0028] 图2为bmo-miR-3378类似物对家蚕BmN细胞中bmo-miR-3378表达量影响的qRT-PCR 检测结果示意图。结果表明，家蚕细胞在转染bmo-miR-3378类似物后，bmo-miR-3378表达量 呈极显著增高(P〈〇. 01)。这说明bmo-miR-3378类似物的处理具有bmo-miR-3378过表达的效 果。
[0029] 图3为bmo-miR-3378抑制物对家蚕BmN细胞中bmo-miR-3378表达量影响的qRT-PCR 检测结果示意图。结果表明，家蚕细胞在转染bmo-miR-3378抑制物后，bmo-miR-3378表达量 呈极显著降低(p〈〇. 01)。这说明bmo-miR-3378类似物处理具有bmo-miR-3378抑制沉默的效 果。
[0030] 图4为bmo-miR-3378类似物对家蚕BmN细胞诱导凋亡影响的Caspase活性检测结果 示意图。结果表明，经bmo-miR-3378类似物