一种锝标耐久霉素分子探针的制作方法
【技术领域】
[0001]本发明属于耐久霉素分子探针技术领域，特别涉及一种锝标耐久霉素分子探针。
【背景技术】
[0002]细胞凋亡在肿瘤细胞对放化疗效应、心肌缺血再灌注损伤、动脉粥样硬化易损斑块、缺血缺氧性脑损伤、心、肝、肺移植排斥反应的监测以及帕金森病等的机制研究有重要作用，而建立一种早期检测细胞凋亡的特异性影像学技术一直是一项临床难题。放射性核素显像由于具有检测灵敏度高的优点，因此，成为发展活体凋亡检测技术的重要研究方向。目前较成熟的凋亡探针膜联蛋白V(Annexin V)已被多项研究证实用于凋亡检测，放射性锝标记的Annexin V(99mTc-AnnexinV)存在较为明显的不足，其分子量较大(36000Da)，血液清除速率较慢，肝脏本底十分明显。因此，注射后相对较长时间内靶器官/本底放射性计数比仍然不能达到最佳水平，另外Annex in V主要与凋亡细胞中的脂酰丝氨酸(phosphatidylserine，PS)结合，由于哺乳动物中凋亡细胞中PS远低于磷脂酰乙醇胺(phosphatidylethanolamine，PE)，革E点的亲和力较低，限制了其在临床的实际应用。
[0003]耐久霉素(Duramycin)是由19个氨基酸构成的最小的三维结构聚肽，能以1:1的比例与PE结合，具有较高的亲和力，并且分子量(1200Da)远小于Annexin V(36000Da)，靶/非靶比值高。HYNIC可作为辅助侧链来标记小分子多肽，根据以往的报道中表现出较好的摄取和清除性质。另外，一步法标记试剂盒的合成，使得放射性核素标记简单易行，且无需进一步纯化。因此，我们对99mTc-HYNIC标记的Duramy c in进行了进一步优化及体内实验。
[0004]常规对Duramycin进行标记都是进行HYNIC单标记，本专利通过优化实验路线创新性的实现了HYNIC对Duramycin的双标记，实现了最终对Duramyc in进行99mTc双放射性标记的目标。相比传统的99mTc单标显像剂，本专利目标产物在不改变主体分子结构的基础上每个分子结构中含有的放射性信号提高一倍，因此明显具有更高的放射活性和比活度，也必将极大的提高生物显像的灵敏度和分辨率，为临床科研工作提供更强大的显像手段。
【发明内容】
[0005]本发明的目的是提供一种锝标耐久霉素分子探针，解决了现有技术中存在的问题。
[0006]本发明所采用的技术方案为:一种锝标耐久霉素分子探针，其制备方法为以下几个步骤:
[0007]步骤一:HYNIC对耐久霉素的修饰:
[0008]1.1.1反应液的配置:
[0009]将HYNIC(琥珀酰亚胺基-6-肼基烟酸盐丙酮腙)溶解到无水DMF(二甲基甲酰胺)中，配置成溶液I，最终浓度为20mg/100uL;将耐久霉素溶解到无水DMF中，配置成溶液2，最终浓度为lmg/100uL;将DIEA(二异丙基乙胺)配置成DMF溶液3，浓度为5mg/100uL。
[0010]1.1.2HYNIC与耐久霉素的共价偶联:
[0011]于1.5mL EP管内依次加入10uL溶液I，10uL溶液2和10uL溶液3，充分混合均匀后，避光，室温下反应15h。
[0012]步骤二:偶联产物的纯化:
[0013]利用HPLC对偶联产物进行纯化，流动相A:含有0.1 %的纯净水；流动相B:含有
0.1 % 的乙腈。梯度洗脱条件:0-5min 10 % A，5_20min ,10% B—90 % B，20_25min 90 % B，25-30min 90%B一10%B，流速4mL/min，检测波长:254nm。
[0014]步骤三:偶联产物的放化标记
[0015]取10ug偶联产物HYNIC-Duramycin加入到含有10mg Tricine(三甲基甘氨酸)、32mg TPPTS(三苯基膦三间磺酸钠)和21ug SnCl的2mL水溶液中。分取其中500uL置于2mL离心管中进行冻干备用。最后将0.5mL活度大于50mCi的99mTc加入到上述备用离心管中80°C反应30分钟即可。
[0016]进一步的，所述步骤二中，梯度洗脱条件为:0-5min 10%Α,5-20πι?η,10%Β—90%B，20-25min 90%B,25-30min 90%B—10%B，流速4mL/min，检测波长:254nm。
[0017]进一步的，HYNIC和耐久霉素的投料比例为20:1。
[00? 8]本发明的有益效果:常规对Duramycin进行标记都是进行HYNIC单标记，本专利通过优化实验路线创新性的实现了HYNIC对Duramyc in的双标记，实现了最终对Duramycin进行99mTc双放射性标记的目标。相比传统的99mTc单标显像剂，本专利目标产物在不改变主体分子结构的基础上每个分子结构中含有的放射性信号提高一倍，因此明显具有更高的放射活性和比活度，也必将极大的提高生物显像的灵敏度和分辨率，为临床科研工作提供更强大的显像手段。
[0019]本研究中的分子探针99mTc双放射性标记的HYNIC-Duramycin(99mTc-d1-HYNIC-Duramycin)在新西兰兔模型中显示出较好的理化和生物学性质，与已发表的鼠模型实验结果基本一致。在体内器官分布实验中，正常新西兰兔耳缘静脉注射99mTc-d1-HYNIC-Duramycin(lmci/kg)30、60、90min后，分别行平面显像观察显像剂血液清除及脏器分布可见该探针主要在心、肝、肾、骨髓及膀胱摄取，随时间心、肝、肾、骨髓的摄取浓度逐渐降至本底水平。在药代动力学实验中，耳缘静脉注射99mTc-d1-HYNIC-Duramycin(lmci/kg) 1、2、3、4、5、10、、30、60，90、120、180min后，分别采集静脉血lml，测定放射性计数，经时间衰减校正后，拟合血液-放射性曲线，其半排时间为2.8 ± 0.2min。
[0020]血管内皮平滑肌细胞和巨噬细胞凋亡异常活跃是造成动脉粥样硬化斑块稳定，弓丨发心肌梗死、猝死等严重临床后果的重要原因。我们采用新西兰大白兔，通过高脂饲料喂养加腹主动脉球囊损伤建立动脉粥样硬化易损斑块模型，喂养3月后进行99mTc-d1-HYNIC-Duramycin活体与离体腹主动脉显像，计算活体显像腹主动脉革E/非革E比值(T/NT)与离体腹主动脉组织测定每克组织百分注射剂量率(% ID/g) J^Tc-d1-HYNIC-Duramycin能够与易损斑块组的腹主动脉易损斑块特异性结合并清晰显像，而正常组腹主动脉摄取很少，易损斑块组腹主动脉T/NT值及％ID/g值明显高于正常对照组(p<0.05)。并且模型组给予阿托伐他汀治疗4周后，99mTc-d1-HYNIC-Duramycin的摄取明显减少，腹主动脉T/NT值及％ ID/g值较治疗前降低(P<0.05)。。因此，99mTc-d1-HYNIC-Duramycin作为一种新型凋亡探针，有望将来运用到临床，更为活体检测易损斑块并且评价药物稳定斑块的疗效的影像学手段。
【附图说明】
[0021]图1 是通过 Ma tr i x_as s i s t ed laser desorpt1n / 1nizat1n massspectrometry (MALDI)对原料耐久霉素的分子量进行确认图谱。