一种抗猪蓝耳病的中药复方、提取方法、浓度和效果测定的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于兽用中药领域，设及一种体外抗猪蓝耳病病毒的中药复方、提取方法、 浓度和效果测定。
【背景技术】
[0002] 猪蓝耳病（亦称猪繁殖与呼吸系统综合征）是由猪繁殖与呼吸系统综合征病毒 (PRRSV)引起猪的W繁殖障碍和呼吸道症状为主要特征的一种高度传染性疾病。该病既能 垂直传染又能水平传播，能够引起妊娠母猪发热、厌食、流产、早产、木乃伊胎、弱仔及诱发 仔猪和育成猪的多种呼吸系统疾病。1996年郭宝清等人确定了其在我国的存在，PRRS具有 传播迅速、流行广泛和毒株变异能力强的特点，该病对养猪业造成严重威胁和巨大经济损 失，防治主要靠疫苗预防，目前尚无有效药物，其综合防制有很大难度。
【发明内容】
[0003] 本发明克服了现有技术中的缺点，提供了一种抗猪蓝耳病的中药复方、提取方法、 浓度和效果测定，其对猪蓝耳病等病毒性疾病的预防和治疗有较好的作用，而且具有毒副 作用少、残留低、资源丰富等优势。
[0004] 为了解决上述技术问题，本发明是通过W下技术方案实现的：
[0005] -种抗猪蓝耳病的中药复方，包含如下药物及其重量份:青葛3份、穿屯、莲2份、板 蓝根2份和赤巧1份。
[0006] 进一步，按照配制8克中药复方为标准，包含如下药物及其重量比例:青葛3克、穿 屯、莲2克、板蓝根2克和赤巧1克。
[0007] -种抗猪蓝耳病的中药复方的提取方法，包括W下步骤：
[000引（1)按青葛3g、穿屯、莲2g、板蓝根2g和赤巧Ig，称取各中药，组成8g中药复方；
[0009] (2)按照步骤（1)的配方称量配方药，水浸泡化，浸泡加水量为中药复方重量的4 倍，然后再加入中药复方重量4倍的水量，煎煮20-30min，过滤得第一次煮液;再加入中药复 方重量的5倍的水量，煎煮20min，过滤得第二次煮液；
[0010] (4)合并2次煮液，于烧杯中加热蒸煮，定容至20ml，每毫升相当于0.4g生药；
[0011] (4)置凉，用离屯、机W转速为3000r/min离屯、lOmin，取上层清液存200ml容量瓶中， 用NaHC〇3溶液调pH值至7.0，经高压灭菌分装于4°C保存备用。
[0012] 对Marc-145细胞安全浓度的测定：
[001引取Marc-145细胞长成单层的96孔培养板，弃原液，PBS洗涂1次，卵MEM完全培养液 对中药原液作2倍倍比稀释至第10孔，每孔l(K)yL，第11、12孔为细胞对照，各稀释度重复4 孔，37 °C、C02培养箱培养至72h，每天观察细胞的形态变化及生长状况，7化后弃去培养液， WPBS液洗涂1次，加入MTT液20化/孔，37 °C继续培养4h后弃MTT液，加入DMS0150μLν孔，恒溫 振荡lOmin待结晶全部溶解，490nm波长下测定0D值；
[0014]根据公式W0D值计算不同浓度复方中药对细胞的生长抑制率，细胞生长抑制率= (细胞对照组OD值-药物组OD值)/细胞对照组OD值，并结合WE观察结果来判断复方中药毒 性的大小，当生长抑制率为0则表明该中药对细胞无毒性作用，结合复方中药的起始浓度， 来确定其最大安全浓度。
[001引进一步，猪蓝耳病病毒的半数韋性浓度(TCID日日)的测定：
[0016] 将待测病毒按10倍比系列稀释至10-10,按10化L/孔的剂量加入长至单层Marc- 145 细胞的 96 孔板，最后 2 列作细胞对照组，各组重复 8 孔， 37°C 吸附 1. 化后弃病毒液，各孔加 入DMEM维持液1 OOyL，C〇2培养箱37 °C培养；
[0017] 每天观察细胞病变作用(CPE)，72-96h后，WMTT法测定各孔0D值，根据下述公式计 算:病毒对细胞的生长抑制率=(细胞对照组0D值-病毒对照组0D值)/细胞对照组0D值，采 用Reed-Muench两氏法，计算病毒的半数毒性浓度(TCID50)，即距离比例=(高于50%的细 胞生长抑制率-50 % )/(高于50 %的细胞生长抑制率-低于50 %的细胞生长抑制率）， Log2TC50 =距离比例X稀释度对数之间的差+高于50%细胞生长抑制率的对数。
[0018] 进一步，W中药复方步骤(4)得到的最大安全浓度为起始浓度，W培养液对中药进 行2倍稀释，共4个浓度，每浓度重复8孔，PRRSV液稀释度为100TCI化0,并设细胞对照和病毒 对照组，0)2培养箱37 °C培养，每天观察细胞WE情况，待细胞培养至72h后，WMTT法测定各 孔0D值，根据公式计算：中药对感染病毒的Marc-145细胞的保护率=(药物组0D值-病毒对 照组0D值)/(细胞对照组0D值-病毒对照组0D值）；
[0019] 1.加药方式
[0020] 采用Ξ种加药方式：
[0021] 方式一、复方中药对病毒的阻断作用(先加中药再加病毒）
[0022] 在Marc-145细胞长至单层的96孔培养板加入W安全浓度起始的复方中药液，100μ L/孔，37 °C培养4h后弃药液，按100μL孔量，加入lOOTCIDsoPRRSV液，37 °C培养化后弃病毒 液，每孔加 DMEM维持液100μΙ^;
[0023] 方式二、复方中药对病毒的抑制作用(先加病毒再加中药）
[0024] 在已长满单层Marc-145细胞的96孔板，加入lOOTCIDsoPRRSV液，每孔100yL，37°C培 养化后弃病毒液，再加入W安全浓度起始的中药复方液，100化/孔，37 °C培养4h，弃药液，每 孔加 DMEM维持液100μΙ^;
[0025] 方式Ξ、中药对病毒的直接杀灭作用（中药与病毒同时加入）
[0026] 配制W中药安全浓度起始，倍比稀释且含100TCI化0病毒液的不同浓度中药复方培 养液，加入已长满单层细胞的96孔培养板，10化L/孔，37 °C培养4h后弃药液，每孔加 DMEM液 100 化；
[0027] 2.数据处理及药物评价
[0028] 用SPSS19.0软件进行统计分析，先计算各中药不同浓度下的平均0D值 X+S玉表示），根据公式计算对细胞的保护率，最后W中药对细胞保护率来评价中药的效 果，细胞保护率越大则说明药物抗PRRSV作用越强
[0029] 与现有技术相比，本发明的有益效果是：
[0030] 本发明所述一种抗猪蓝耳病的中药复方、提取方法、浓度和效果测定具有扶正培 本、调整机体阴阳平衡、增强免疫力、清热解毒、活血化疲和固本解表等功效，能够直接或通 过调节机体免疫力影响病毒的复制。
【具体实施方式】
[0031] W下对本发明的优选实施例进行说明，应当理解，此处所描述的优选实施例仅用 于说明和解释本发明，并不用于限定本发明。
[0032] 本发明所述一种体外抗猪蓝耳病病毒的中药复方，按照配制8克中药复方为标准， 包含如下药物及其重量比例:青葛3克、穿屯、莲2克、板蓝根2克和赤巧1克。
[0033] 下述实施例中所用实验材料如下：
[0034] ( - )细胞与病毒
[0035] 细胞:Marc-145细胞，由华南农业大学兽医微生物学与免疫学实验室惠赠，按常规 方法传代、培养;猪蓝耳病病毒(PRRSV)由华南农业大学兽医学院惠赠。
[0036] (二）主要试剂
[0037] 胎牛血清、膜蛋白酶、DMEM培养液均为HyC10ηe产品；二甲基亚讽（DMS0)购自 GIBIC0公司；嚷挫蓝(MTT)为SIGMA产品，W无 Ca2\Mg2+的PBS液配制成5mg/mL，过滤除菌分 装，-20°C避光保存备用。
[003引（立）中药的提取
[0039] 采用水煎煮方法进行粗提，具体步骤是：
[0040] 1.按青葛2g、穿屯、莲2g、板蓝根2g和赤巧Ig重量份称取各中药，组成8g中药复方；
[0041] (2)按照配方称量配方药，加水浸泡化，第一次加水量8倍，煎煮20-30min，过滤煮 液;第二次加水量5倍，煎煮20min，过滤煮液。
[0042] (3)合并2次煮液，于烧杯中加热蒸煮，定容至20ml，每毫升相当于0.4g生药（即 400mg/mL)；
[0043] (4)置凉，300化离屯、lOmin，取上层清液存200ml容量瓶中，用化肥化溶液调抑值至 7.0，静高压灭菌分装于4°C保存备用。
[0044] 中药复方对Marc-145细胞安全浓度和猪蓝耳病病毒的半数毒性浓度(TCI化0)的测 定。
[0045] 1.复方中药对Marc-145细胞安全浓度的测定
[0046] 取Marc-145细胞长成单层的96孔培养板，弃原液，PBS洗涂1次，WDMEM完全培养液 对中药原液作2倍倍比稀释至第10孔，每孔l(K)yL，第11、12孔为细胞对照，各稀释度重复4 孔，37°C、0)2培养箱培养至72h，每天观察细胞的形态变化及生长状况。7化后弃去培养液， WPBS液洗涂1次，加入MTT液20化/孔，37 °C继续培养4h后弃MTT液，加入DMS0150μLν孔，恒溫 振荡1 Omin待结晶全部溶解，490nm波长下测定0D值。
[0047] 根据公式WOD值计算不同浓度复方中药对细胞的生长抑制率，细胞生长抑制率= (细胞对照组0D值-药物组0D值)/细胞对照组0D值，并结合WE观察结果来判断复方中药毒 性的大小，当生长抑制率为0则表明该中药对细胞无毒性作用，结合复方中药的起始浓度， 来确定其最大安全浓度。
[0048] 2.猪蓝耳病病毒的半数毒性浓度(TCI化0)的测定
[0049] 将待测病毒按10倍比系列稀释至10-10,按10化L/孔的剂量加入长至单层Marc- 145 细胞的 96 孔板，最后 2 列作细胞对照组，各组重复 8 孔， 37°C 吸附 1. 化后弃病毒液，各孔加 入DMEM维持液1 OOyL，C02培养箱37 °C培养。
[0050]每天观察细胞病变作用(CPE)，72-96h后，WMTT法测定各孔OD值。根据下述公式计 算:病毒对细胞的生长抑制率=(细胞对照组0D值-病毒对照组0D值)/细胞对照组0D值。采 用Reed-Muench两氏法，计算病毒的半数毒性浓度(TCI化0)，即距离比例=(高于50%的细胞 生长抑制率-50% )/(高于50%的细胞生长抑制率-低于50%的细胞生长抑制率）DLog2TC50 =距离比例X稀释度对数之间的差+高于50%细胞生长抑制率的对数。
[0化1] 3.数据处理
[0052] 用SPSS19.0软件进行统计分析，先计算不同浓度的中药复方的平均