含有白介素15的防治hpv感染的疫苗喷雾剂的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明设及一种防治HPV感染的疫苗喷雾剂组方，所述组方包括HPV病毒颗粒及 细胞因子如白介素15,属于生物制药领域。
【背景技术】
[0002] 乳头瘤病毒是小DNA肿瘤病毒，具有高度物种转移性。迄今为止，有记载的个体人 乳头瘤病毒（HPV)基因已超过100种。HPV通常或对皮肤专一（例如HPV-I和HPV-2)，或 者对黏膜表面专一，而且一般会引起持续数月或数年的良性肿瘤。此类良性肿瘤可能引起 患者的不安，但除了少数例外情况，并不会对生命造成威胁。
[0003] 在HPV引起的人类疾病中，妇女宫颈的HPV感染最为常见，危害性也最大，HPV是 慢性宫颈炎的主要病原。在宫颈粘膜柱状上皮和鱗状上皮转变的区带处，是嗜粘膜型乳头 瘤病毒繁殖的部位，也是慢性宫颈炎的好发部位。慢性宫颈炎的病因复杂，1989年中国病毒 基因工程国家重点实验室和北京天坛医院合作研究发现，慢性宫颈炎患者宫颈中HPV的检 出率均明显高于正常宫颈。HPV16感染与慢性宫颈炎关系更为密切，我国的研究发现，慢性 宫颈炎患者的宫颈组织和洗液中，HPV16的检出率可高达20% -50%。
[0004] 一些HPV还与癌症有关，被称为至癌HPV型。HPV-16和HPV-18与宫颈癌之间存 在的关联是HPV与人类癌症间最为肯定的关联。在发展中国家，宫颈癌是最为普遍的恶性 肿瘤，严重威胁着妇女的健康和生活质量。其发生发展已呈现年轻化的趋势，由于地区间的 不同宫劲癌发病有河大差异，我国约占世界1/3。引起宫颈癌的HPV型别较多，近年来研究 鉴定了 30个型别的HPV与宫颈癌有关，与癌症有特殊关联的其它HPV型分别有31、33、35、 39、45、51、52、56、58、59、66和68型。其中16、18、45、31型别占全球宫颈癌病因的80%， 宫颈癌是世界上妇女仅次于乳腺癌的第二位最常见的癌症，是全球妇女癌症死亡率的第= 位，全球每年约有50万新宫颈癌病例，每年约有27万妇女死于此病。 阳0化]此外，HPV也可能在某些头颈部的癌瘤W及更致命的黑素瘤和其它癌症中起作用 (参见例如，Mellin. et al, Internat. J. Cancer, 2000, 89:300 ;Zumbach, et al. Internat J. Cancer, 2000, 85:815 !Drear, et al. Annals Su;rgery. 2000, 231:664)。
[0006] 目前晚期宫颈癌的治疗尚无良策，早期宫颈癌及癌前病变的治疗多采用药物腐 蚀、激光冷冻及宫颈锥形切除，不能防止乳头瘤病毒再感染的可能性，且技术条件要求相对 较高，不适合落后地区推广应用，而对无症状的慢性持续性感染则无对策。
[0007] 2006年6月，美国抑A批准了 Merck公司开发生产的4价化，11，16和18型）HPV 疫苗GARDASIL篡，不仅是人类第一个特异性预防癌症的疫苗，也是第一个不仅预防宫颈 癌，也预防性性痛的疫苗，可W预防有HPV6、11、16和18引起的感染，预防宫颈癌和性痛，批 准用于9-26岁的女性。
[0008] 已有人提出，HPV的病毒样颗粒（VLP)有可能成为治疗HPV的疫苗，动物研究表 明，VLP对其它HPV型感染不产生交叉保护作用，参见例如Suzich, J.A.等，Proc化tl Acad Sci, 92:11553-11557, 1995 ;和 Brei忧urd, Seminars in Cancer Biology,第 9 卷，第 431-445 页，1999。
[0009] 申请号为200380109729. 2的中国专利公布了 HPV-16和HPV-18L1VLP的疫苗，包 含HPV16的VLP和HPV18的VLP的组合物在制备用于预防有一组致癌HPV型中的一种或多 种HPV型引起的感染和/或疾病药物中的用途，运种疫苗是HPV的VLP和佐剂联合应用，佐 剂是侣盐和3D-MPL的组合，正在运篇专利申请中还提到了运种包含HPV16和HPV18的VLP 的混合物在预防由 HPV31、HPV33、HPV35、HPV39、HPV45、HPV51、HPV52、HPV56、HPV58、HPV59、 HPV66和HPV68引起的感染性疾病的发生，通式在该专利中还提到了运种疫苗可W通过口 月良、局部、皮下、黏膜（阴道内）、静脉、肌肉、鼻下、舌下、真皮及通过栓剂供给。
[0010] 2006年10月的《国际肿瘤学杂志》公布了题为"人乳头瘤病毒疫苗临床试验进 展"，文中提到了治疗HPV感染的疫苗，运类疫苗包括多肤疫苗，病毒载体疫苗W及DNA疫 苗，结果表明用HPV16E43-77的35个氨基酸长的肤制成的多肤疫苗具有治疗HPV病毒感染 的效果，同样HPV16和HPV18的E6和E7蛋白重组痘苗病毒载体疫苗也可W治疗HPV病毒 的感染。
[0011] 中国专利CN200710188168.X公开了防治人乳头瘤病毒感染的复方疫苗组合物， 在所述的疫苗组合物物中，在HPV16和HPV18病毒颗粒组合物基础上，辅W人干扰素等细胞 因子，既可预防宫颈癌又可治疗HPV感染，包括慢性宫颈炎、宫颈上皮发育不良，防治两用， 而且适用于任何年龄的已婚妇女，可W反复使用。组合物中，除人干扰素细胞因子外，还包 括人白介素2、人白介素12、胸腺素0 W及乳铁蛋白细胞因子。 阳〇1引发明概述
[0013] 本发明基于在中国专利CN200710188168.X的基础上，提供了一种改良的防治人 乳头瘤病毒感染的复方疫苗组合物，研究人员发现，W白介素15替代CN200710188168. X中 的IL-2及IL12,用于HPV病毒感染的疾病防治时，具有更佳的免疫效果，表现在可W获得更 高的IgG、SlgA抗体水平；细胞免疫检测时，也可W检测到更高的IFN-丫水平。
[0014] 具体地，本发明的目的在于提供一种新的包括HPV16的VLP和HPV18的VLP的疫 苗组合物，在此基础上，辅W人白介素15 W及带正电荷的多糖壳聚糖，所述组合物即可预 防宫颈癌又可治疗HPV感染，包括慢性宫颈炎、宫颈上皮发育不良等，不仅对HPV16和18感 染有预防作用，对其它型别HPV感染也有一定的交叉保护作用，还可W产生系统免疫W及 局部黏膜免疫，制成喷雾剂后可用于阴道喷雾，使用方便。
[0015] 粘膜免疫系统是机体整个免疫网络的重要组成部分，也是具有独特结构和功能的 独立免疫体系，它在抵抗感染方面起着极其重要的作用。粘膜表面是人体与外界抗原直接 接触，是机体抵抗感染的第一道重要防线。除注射免疫所诱导的体液免疫和细胞免疫之外， 粘膜免疫最主要的功能是诱导局部免疫。实验证明：通过粘膜免疫后，粘膜局部的抗体比血 清抗体出现得早、效价高，且维持的时间长。
[0016] 分泌型IgA(SlgA)是粘膜应答过程中的主要效应因子，SlgA的粘膜亲和性与抵抗 蛋白酶的作用，均有助于其对病毒、细菌的亲和作用。由于外分泌液中SlgA含量多，又不容 易被蛋白酶破坏，故成为抗感染、抗过敏的一道主要屏障。研究结果显示，在粘膜的某处受 到抗原刺激的粘膜活性细胞，尤其是在肠道或鼻腔内粘膜的刺激，会在机体的其他粘膜部 位，例如肺产生相应的特异性免疫反应。也就是通过口服或滴鼻接种疫苗，可W使机体全部 的粘膜获得抵御相应传染病的免疫保护力。
[0017] 虽然从粘膜途径接种疫苗产生的主要是局部免疫反应，但是实验结果显示粘膜免 疫也能产生很高的血清抗体效价，也能诱导细胞毒T淋己细胞的活性。
[0018] 进一步地，本发明用于防治HPV感染的疫苗喷雾剂，所述疫苗喷雾剂，W每毫升量 计算，包括：防治有效量的灭活病原体，所述灭活病原体为HPV-16的Ll蛋白病毒样颗粒和 /或HPV-18的Ll蛋白的病毒样颗粒；5-50万单位的人白介素15 ; I-IOmg的壳聚糖；W及 用于调节抑至4. 0~6. 0范围内的憐酸盐缓冲液。
[0019] 所述的防治有效量的灭活病原体，是指防治有效量的灭活HPV病毒，如HPV-16的 Ll蛋白病毒样颗粒和/或HPV-18的Ll蛋白病毒样颗粒，防治有效量的范围，是指能对感 染了 HPV病毒的患者，于本领域的技术人员来说，结合现有技术中HPV灭活病原体在HPV 感染中的运用，是容易确定的，本发明中，优选的用量是每毫升喷雾剂中包括40-120mg的 HPV-16L1蛋白病毒样颗粒和/或40-120mg的HPV-18L1蛋白病毒样颗粒。
[0020] 其中，HPV-16和HPV-18蛋白为Ll全长基因按酵母的密码偏嗜性改造后在酵母中 表达并纯化，运种改造可W用生物学软件Vector NTI 10对HPV16、18的密码子进行全基 因改造，Ll蛋白形成病毒样颗粒（VLP)，形成完整的空间构想，保持其抗原性。HPV-16和 HPV-18的Ll蛋白的VLP制备已经为现有技术，具体参见专利W09913056. HPV-16和HPV-18 的LI蛋白的VLP可引起较好的免疫反应。
[0021] 白细胞介素15 (比-15)是Gr油stein等人于1994年发现的一种约为12-14kD的 细胞因子，天然人白介素15成熟肤含有114个氨基酸。与大多数细胞因子相似，比-15可 在机体正常的免疫