调控AKT3基因表达的miRNA-382的用图
【技术领域】
[0001] 本发明设及分子生物学技术领域，具体设及能调节AKT3基因表达的小分子非编码 RNA miRNA-382的用途。
【背景技术】
[0002] 据统计，2015年全国累计登记吸毒人员295.5万名，其中滥用阿片类毒品人员 145.8万名、滥用合成毒品人员145.9万名，分别占49.3%和49.4%。
[0003] 1874年，英国伦敦圣玛莉医院的化学家莱特，在吗啡中加入醋酸酢等物质，首次提 炼出镇痛效果更佳的半合成化衍生物，二乙酸吗啡，运就是最早合成的海洛因。海洛因成癒 是指任何原因引起的非医疗目的地滥用海洛因等阿片类药物，滥用个体在难W自制的强迫 性反复连续用药过程中，形成了药理学和毒理学的精神依赖性与生理依赖性，一旦中断用 药即可出现戒断症状和体征，使滥用个体处于一种阿片药物的慢性中毒状态。海洛因成癒 是一种慢性、复发性脑病，长期成癒性药物的使用可使神经系统发生可塑性变化，分子和细 胞发生适应性变化，运些过程设及表观遗传学修饰。
[0004] MicroRNA,即miRNA是在真核生物中发现的一类内源性的具有调控功能的小分子 非编码RNA，其大小长约20~25个核巧酸。成熟的miRNA是由较长的初级转录物经过一系列 核酸酶的剪切加工而产生的，随后组装进RNA诱导的沉默复合体(RNA-induced silencing (3〇1啡1心1?15〇，通过碱基互补配对的方式识别祀信使1?酷，即1111?酷，并根据互补程度的不同 指导沉默复合体降解祀mRNA或者阻遏祀mRNA的翻译。最近的研究表明，miRNA参与各种各样 的调节途径，包括发育、病毒防御、造血过程、器官形成、细胞增殖和调亡、脂肪代谢等等。研 究表明，miRNA在转录后水平通过诱导mRNA的降解或抑制其翻译从而抑制祀基因的表达，起 到调控基因表达的作用。研究发现，miRNA在神经元细胞分化、突触可塑性及药物成癒过程 中发挥了重要的作用;在动物组织和人类组织中均存在有稳定表达的miRNA,且不会被内源 性RNA酶降解，从而为成癒性疾病神经生物学机制研究提供了全新的视角。
[0005] 在我国海洛因吸食者占吸毒人员近50%，对于海洛因成癒治疗主要将美沙酬口服 液作为治疗药物，对海洛因成癒者进行长期维持治疗，目的是减轻其对海洛因的依赖，而美 沙酬本身具有成癒性，只是相比海洛因成癒性小，所W目前并没有针对海洛因成癒的有效 药物。因此，本领域迫切需要寻找能够治疗或抑制海洛因成癒的安全、有效的方法，并与之 相配合使用的药物和检测方法。
【发明内容】
[0006] 为了解决上述海洛因成癒无有效治疗方式和药物的技术问题，本发明公开了调控 AKT3基因表达的miRNA-382的用途，所述miRNA-382能特异性、高效性的与祀基因 AKT3结合， 下调祀基因表达，从而为海洛因复吸成癒提供一种有效的抑制方法，并基于此提供了 miRNA-382和AKT3基因在制备海洛因复吸药物的用途。
[0007] 本发明人通过大量科学实验发现大鼠海洛因成癒和戒断复吸后中脑伏隔核区 miRNA-382表达量发生显著变化，并由此推断大鼠海洛因复吸行为与miRNA-382表达量有 关，通过科学实验验证miRNA-382过表达可显著抑制大鼠海洛因复吸行为。
[000引本发明公开了一种调控AKT3基因表达的miRNA-382在制备抑制海洛因复吸药物中 的用途，所述miRNA-382核巧酸序列如SEQ ID NO. 1所示，所述AKT3 mRNA核巧酸序列如SEQ ID NO.2所示。
[0009] 在本发明公开的调控AKT3基因表达的miRNA-382在制备抑制海洛因复吸药物中的 用途的一种较佳的实施例中，所述miRNA-382通过调节AKT3的表达量，W抑制海洛因复吸行 为。
[0010] 在本发明公开的调控AKT3基因表达的miRNA-382在制备抑制海洛因复吸药物中的 用途的一种较佳的实施例中，过表达调节所述miRNA-382通过构建含所述miRNA-382目标基 因的慢病毒LV-miRNA-382并用所述LV-miRNA-382感染宿主细胞实现。
[0011] 在本发明公开的一种调控AKT3基因表达的miRNA-382在制备抑制海洛因复吸药物 中的用途的一种较佳的实施例中，所述LV-miRNA-382的过表达慢病毒载体为化i-MCS-SV40-EGFP。
[0012] 本发明还公开了一种结合miRNA-382的AKT3基因在制备海洛因复吸药物中的用 途，所述miRNA-382核巧酸序列如SEQ ID NO. 1所示，所述AKT3 mRNA核巧酸序列如SEQ ID NO. 2所示。
[0013] 在本发明公开的结合miRNA-382的AKT3基因在制备海洛因复吸药物中的用途的一 种较佳的实施例中，所述miRNA-382通过调节AKT3的表达量，W抑制海洛因复吸行为。
[0014] 相较于相关技术，本发明提供的调控AKT3基因表达的miRNA-382的用途具有W下 有益效果：
[0015] -、成功建立大鼠海洛因自身给药模型，为其他相关成癒性药物研究提供参考。
[0016] 二、成功验证miRNA-382在海洛因自身给药大鼠伏隔核中的表达变化，并与忍片结 果一致，并证明miRNA-382与大鼠海洛因成癒和复吸相关，为后续研究提供依据。
[0017] S、通过构建LV-miRNA-382慢病毒表达载体可升高miRNA-382在伏隔核表达，干预 AKT3mRNA表达，抑制海洛因成癒戒断后线索诱导的复吸。
[001引四、通过包装慢病毒LV-siRNA-AKT3验证AKT3蛋白表达与海洛因复吸相关。
[0019] 五、miRNA-382可用于作为针对海洛因成癒治疗和抗复吸的基因药物，干预AKT3表 达可作为潜在治疗海洛因复吸的药物祀标，有望弥补现有无治疗海洛因成癒和复吸的基因 药物空白。
【附图说明】
[0020] 为了更清楚地说明本发明实施例中的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使 用的附图作简单的介绍。显而易见，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本 领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可W根据运些附图获得其它的 附图，其中：
[0021 ]图1为大鼠海洛因成癒模型建立折线图；
[0022] 图2(a)为戒断后线索诱导海洛因复吸大鼠的伏隔核差异表达miRNA的聚类图；
[0023] 图2(b)为图2(a)的部分放大图；
[0024]图3为大鼠海洛因成癒戒断线索诱导后miRNA-382的RT-PCR表达量柱状图；
[002 引 图 4(a)为 LV-miRNA-382表达载体 Ubi-MCS-SV40-EGFP 图谱；
[0026] 图 4 (b)为LV-S iRNA-AKT3表达载体 Ue-MCS-Ub i -EGFP 图谱；
[0027] 图5为LV-miRNA-382转染脑区位置图，图5中（a)为4倍显微镜图，图5中（b)为10倍 显微镜图，图5中（C)为20倍显微镜图；
[0028] 图6为海洛因成癒模型大鼠伏隔核注射LV-miRNA-382后复吸行为测试柱状图；
[0029] 图7为海洛因成癒模型大鼠伏隔核注射LV-miRNA-382的RT-PCR实验miRNA-382表 达量柱状图；
[0030] 图8(a)为大鼠海洛因成癒戒断14天线索诱导后与空白对照组AKT3蛋白聚丙締酷 胺凝胶电泳图；
[0031] 图8(b)为大鼠海洛因成癒戒断14天线索诱导后与空白对照组AKT3蛋白表达量柱 状图；
[0032] 图9为大鼠海洛因成癒戒断14天线索诱导后与空白对照组RT-PCR实验AKT3 mRNA 表达量柱状图；
[0033] 图10(a)为海洛因成癒模型大鼠伏隔核注射LV-miRNA-382后AKT3蛋白聚丙締酷胺 凝胶电泳图；
[0034] 图10(b)为海洛因成癒模型大鼠伏隔核注射LV-miRNA-382后AKT3蛋白表达量柱状 图；
[00巧]图11为海洛因成癒模型大鼠伏隔核注射LV-miRNA-382后RT-PCR实验AKT3 mRNA表 达量柱状图；
[0036] 图12为海洛因成癒模型大鼠伏隔核注射LV-siRNA-AKT3后复吸行为测试柱状图；
[0037] 图13(a)为海洛因成癒模型大鼠伏隔核注射LV-siRNA-AKT3后AKT3蛋白聚丙締酷 胺凝胶电泳图；
[0038] 图13(b)为海洛因成癒模型大鼠伏隔核注射LV-siRNA-AKT3后AKT3蛋白表达量柱 状图；
[0039] 图14为海洛因成癒模型大鼠伏隔核注射LV-siRNA-AKT3后RT-PCR实验AKT3 mRNA 表达量柱状图；
[0040] 图15为AKT3WT和AKT3 mu化nt的表达载体SV40-LUC-MCS构建图谱；
[0041 ] 图16为双巧光素酶检测miRNA-382干预AKT3基因后相对巧光表达量柱状图。
【具体实