适用于细胞培养物的聚合物的制作方法【专利说明】适用于细胞培养物的聚合物[0001]本发明设及制备适用于细胞培养物的聚合物的方法。本发明还设及细胞培养物用于制造前血管（prevas州Iar)系统的用途。[0002]迄今为止，细胞培养物凝胶材料可从天然来源中分离或者完全合成。凝胶例如胶原固有地产生片层结构，其不能单独形成复杂的3D网络。凝胶例如来源于EHS小鼠肉瘤细胞的那些凝胶比纯胶原更类似于在组织中发现的细胞外环境，并且还提供细胞可在其中生长和组装成复杂体系结构的=维环境。天然来源的凝胶剂难W充分表征并且需要密集的批次间分析W实现运种表征，生物来源的凝胶遭受固有的变异性、污染和病原体传递的风险W及过度的溢价。对于许多研究小组，额外的痕量污染例如固有地存在于生物来源材料中的不想要的生长因子是不能接受的实验干扰且对于体内使用而言是不能接受的。另一方面，合成来源的凝胶例如衍生自聚(N-异丙基丙締酷胺)共聚物的那些凝胶展示出低的细胞存活率和细胞分化能力，运需要额外的生物活性物例如糖皮质激素和转化生长因子e(TGF-e)的混合物。合成凝胶剂的使用在很大程度上除去了在生物凝胶剂中发现的自然变异，但同时也消除了天然凝胶的固有生物活性。消除生物变异性同时保留生物活性的能力是尚未完全实现的挑战。[0003]收获在运些凝胶中形成的复杂生物系统的能力也仍然是一个挑战。传统上，必须通过使用膜蛋白酶从生物表面释放细胞或者将凝胶机械溶解或手动从结构表面除去。[0004]上文展示的可凝胶化的（gelatable)结构在自然界中并不普遍且不能在体内W微创方式简单应用。存在能够通过冷却导管W微创方式应用的热响应性材料的一些实例，例如US2010/0215731Al中公开的那些。然而，运些材料遭受与上文所述相同的缺点，从而导致差的细胞存活率。[0005]机械地，所有生物来源凝胶的性质由肤亚基的非共价相互作用决定。结果是孔径和机械强度相对固定。在合成得到的凝胶的情况下，机械性质和交联属性甚至更加固定。[0006]WO2011/007012公开了一种水凝胶，其包含低聚（亚烷基二醇）官能化的聚异氯肤。聚异氯肤(9〇1如30。7日11〇9691：1(163)是通过利用低聚(亚烷基二醇)侧链使异氯肤官能化并随后使低聚-亚烷基二醇-官能化的异氯肤聚合来制备的。WO2011/007012建议使用水凝胶用于组织工程或神经元再生。[0007]虽然已知的细胞培养物对于一些应用是令人满意的，但本领域中对可被用于大范围情景的细胞培养物的需求仍在增加。[000引本发明的一个目标是提供细胞培养物和用于细胞培养物的聚合物，其中上文提到的和/或本领域中的其它需求被满足。[0009]根据一个方面，本发明提供了制造低聚（亚烷基二醇）官能化的共聚异氯肤的方法，其中所述方法包括W下步骤：[0010]i)使[0011]-用联结基团接枝的低聚(亚烷基二醇)官能化的异氯肤的第一共聚单体和[0012]-未接枝的低聚(亚烷基二醇)官能化的异氯肤的第二共聚单体[0013]共聚，[0014]其中第一共聚单体与第二共聚单体之间的摩尔比为1:500-1:30,和[0015]ii)向通过步骤i)得到的共聚物中加入细胞粘附因子和间隔单元的反应物，其中间隔单元由通式A-L-B代表，其中联结基团和基团A被选择W反应和形成第一偶联，并且细胞粘附因子和基团B被选择W反应和形成第二偶联，其中第一偶联和第二偶联独立地选自由烘控-叠氮化物偶联、二苯并环辛烘-叠氮化物偶联、氧杂降冰片二締基-叠氮化物偶联、乙締基讽-硫醇偶联、马来酷亚胺-硫醇偶联、甲基丙締酸甲醋-硫醇偶联、酸偶联、硫酸偶联、生物素-链霉亲和素（S化epavidin)偶联、产生酷胺键的胺-簇酸、产生醋键的醇-簇酸偶联和畑S-S旨(N-径基班巧酷亚胺醋)-胺偶联组成的组，且[0016]其中基团L是线性链段，其主链中具有10-60个选自C、N、0和S的原子之间的键。[0017]联结基团和基团A被选择W反应和形成第一偶联，所述第一偶联可W是W上列表中提到的任何偶联。例如，为了获得烘控-叠氮化物偶联，联结基团可W是烘控且基团A可W是叠氮化物，或者联结基团可W是叠氮化物且基团A可W是烘控。W上列表中提到的偶联是本领域技术人员公知的且偶联的形成可在教科书中找到。例如，N此-COOH偶联可通过抓C介导。[0018]优选地，第一偶联是烘控-叠氮化物偶联。[0019]类似地，细胞粘附因子和基团B被选择W反应和形成第二偶联，所述第二偶联可W是W上列表中提到的任何偶联。优选地，第二偶联是NHS-醋(N-径基班巧酷亚胺醋)-胺偶联或者马来酷亚胺-硫醇偶联。运可W是NHS-醋与细胞粘附因子(多肤）的N端的偶联或者马来酷亚胺与细胞粘附因子(多肤)的末端硫醇的偶联。[0020]基团L是具有连接反应基团A和B的线性链的区段。该区段由一系列选自C、N、0和S的原子形成。连接到基团A和B的主链中原子之间的键的数目为至少10个且至多60个。术语"主链"被理解为表示W最短距离连接基团A和B的链。连接到末端基团A和B的主链中原子之间的键的数目优选地为至少12个，更优选地至少15个。连接到末端基团A和B的主链中原子之间的键的数目优选地为至少50个，更优选地至少40个。[0021]已发现:共聚物骨架和细胞粘附因子之间一定的最小距离是培养附着于细胞粘附因子的细胞所必需的。已发现所给出的至少10个键的距离是必要的，运通过存在根据本发明的间隔单元来提供。已发现低于10个键的长度不允许充分的细胞生长。[0022]基团L的优选实例如下：[0024]其中P为1-10,优选地为2-5，[0026]其中q为1-9,优选地为2-5，[0028]其中r为1-10,优选地为2-5。[0029]当间隔单元包含运些类型的基团L时，能够保证特别稳定的细胞生长而不依赖于联结基团、细胞粘附因子、和基团A和B的类型和大小。[0030]根据另一方面，本发明提供通过根据本发明的方法能够得到的低聚(亚烷基二醇）官能化的共聚异氯肤。[0031]根据另一方面，本发明提供包含水凝胶的细胞培养物，所述水凝胶包含浓度为1.2-3.Omg/mL的低聚(亚烷基二醇馆能化的共聚异氯肤，其中通过W下步骤来制造所述共聚异氯肤：[0032]i)使[0033]-用联结基团接枝的低聚(亚烷基二醇)官能化的异氯肤的第一共聚单体和[0034]-未接枝的低聚(亚烷基二醇)官能化的异氯肤的第二共聚单体[00对共聚，[0036]其中第一共聚单体与第二共聚单体之间的摩尔比为1:500-1:30,和[0037]ii)向通过步骤i)得到的共聚物中加入细胞粘附因子和间隔单元的反应物，其中间隔单元由通式A-L-B代表，其中联结基团和基团A被选择W反应和形成第一偶联，且细胞粘附因子和基团B被选择W反应和形成第二偶联，其中第一偶联和第二偶联独立地选自由烘控-叠氮化物偶联、二苯并环辛烘-叠氮化物偶联、氧杂降冰片二締基-叠氮化物偶联、乙締基讽-硫醇偶联、马来酷亚胺-硫醇偶联、甲基丙締酸甲醋-硫醇偶联、酸偶联、硫酸偶联、生物素-链霉亲和素偶联、产生酷胺键的胺-簇酸、产生醋键的醇-簇酸偶联和NHS-醋(N-径基班巧酷亚胺醋)-胺偶联组成的组，且[003引其中基团L是线性链段，其主链中具有10-60个选自C、N、0和S的原子之间的键。[0039]发明人已出乎意料地发现:仅在特定浓度的细胞粘附因子下能实现最佳的细胞生长，其中所述细胞粘附因子被置于距离构建水凝胶的=维结构的聚合物骨架有一定距离。[0040]如果细胞粘附因子的浓度过低，则细胞不会充分粘附于水凝胶，运反过来不允许细胞被培养。如果细胞粘附因子的浓度过高，则细胞在凝胶中不生长。[0041]第一共聚单体是用联结基团接枝的低聚(亚烷基二醇)官能化的异氯肤。联结基团的优选实例包括叠氮化物（例如，氧杂降冰片二締基-叠氮化物）、烘控(例如，二苯并环辛烘）、硫醇、乙締基讽、马来酷亚胺、甲基丙締酸甲醋、酸、生物素、链霉亲和素、NH2、C00H、0H、N服-醋。特别优选的是叠氮化物。[0042]式(I)中显示了第一共聚单体的一个实例，其中联结基团是叠氮化物。[0044]第二共聚单体是未用联结基团或其它基团接枝的低聚（亚烷基二醇）官能化的异氯肤，即异氯肤的侧链由低聚(亚烷基二醇)组成。式（II)中显示了第二共聚单体的一个实例。[0046]第一共聚单体和第二共聚单体在步骤（i)中共聚。获得了低聚（亚烷基二醇）官能化的共聚异氯肤，其包含W第一共聚单体和第二共聚单体的比例包含该聚合物的联结基团。[0047]细胞粘附因子通过间隔单元粘附于共聚物。首先制造细胞粘附因子和间隔单元的反应物。式(III)中显示了间隔单元的一个实例[0049]其中P为1-10。[0050]在运个实例中，基团A是[0化2]基团B是[0054]基团L是[0056]式（IV)中显示了细胞粘附因子的一个实例，其是由甘氨酸、1^-精氨酸、甘氨酸、L-天冬氨酸和丝氨酸组成的五肤(GRGDS)。[0058]式(V)中显示了式(III)的间隔单元和式(IV)的细胞粘附因子的反应物。[0060]在本发明的步骤ii)中，使间隔单元和细胞粘附因子的反应物(例如，式(V))与通过步骤i)获得的共聚物反应。联结基团与对应于间隔单元的那部分反应物反应。因此，最终的共聚异氯肤包含W第一共聚单体和第二共聚单体的比例沿着该聚合物的细胞粘附单元。最终的共聚异氯肤的一个实例由式(VI)代表：[0062]其中m:n是第一共聚单体和第二共聚单体的配比。[0063]通过使用间隔单元，细胞粘附单元被置于距离异氯肤聚合物骨架一定距离。[0064]水凝胶由通过利用合适的细胞培养基胶凝得到的共聚物制成。水凝胶是=维水凝胶。水凝胶中的聚合物浓度为1.2-3.Omg/mL。如果水凝胶中的聚合物浓度过低，则细胞不会粘附于水凝胶。如果水凝胶中的聚合物浓度过高，则水凝胶变得太过坚硬从而使细胞不能在凝胶中移动和生长。[0065]优选地，水凝胶在35°C下通过板-板流变学实验测量的弹性模量为10-5000Pa、优选地100-1000化。运允许细胞移动和生长W形成细胞网络和3D结构，如例如前血管系统。[0066]本发明提供了水凝胶细胞培养物，所述水凝胶具有选择性的刚度和溫度响应性W及可控的空间分布和细胞粘附点的密度。共聚导致细胞粘附基团W第一共聚单体和第二共聚单体的比例沿着聚合物统计分布。第一共聚单体和第二共聚单体的配比可被调节W控制沿着聚异氯肤的聚合物骨架的细胞粘附因子之间的距离。沿着聚合物骨架的细胞粘附因子之间的平均距离可W例如为1.1-60皿。细胞粘附因子之间的运种距离范围适合将待被培养的细胞错固到细胞培养物上。更优选地，细胞粘附因子之间的平均距离为8-30nm。[0067]水凝胶可包含各种细胞培养基，且细胞培养物已显示出介导复杂生物支架的形成。[0068]根据本发明的细胞培养物极其有益，因为培养的细胞易于收集。细胞培养物中所使用的水凝胶具有热响应特征，即，它通过被冷却至低于胶凝溫度的溫度而变成液体。因此，通过仅冷却细胞培养物即可收集培养的细胞。水凝胶变成液体之后，可从液体中收集细胞而不损害培养的细胞。[0069]人们认为细胞粘附因子不能直接粘附于低聚-亚烷基二醇官能化的异氯肤W保持充分的结合。运通过使用根据本发明的间隔物而被解决。根据本发明所使用的间隔单元将细胞粘附因子与异氯肤的聚合物骨架分开W消除空间粘连(blocking)。间隔物使细胞粘附因子的移动与聚合物骨架解偶联，使移动解偶联允许细胞粘附因子有效进入整合素结合囊(pocket)。间隔物应该有极性、水溶性、生物相容性且当前第1页1 2 3 4 5 6