一种新型的胰岛素－磷脂－壳聚糖自组装微粒载体及其制剂的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及医药技术领域，确切地说是一种以脂质复合物为中间载体的胰岛素一 磷脂一壳聚糖自组装微粒载体及其制剂和制备方法。
【背景技术】
[0002] 随着生物技术的不断发展，蛋白多肽类药物的应用愈加广泛。胰岛素作为一种具 有降血糖作用的蛋白多肽类药物，多年以来，临床上一直以注射的方式进行给药，长期频繁 的注射给病人造成极大的不适与痛苦，因此，胰岛素的非注射方式给药一直受到广泛的关 注。其中，以口服给药的方式对胰岛素进行给药，能够模拟体内胰岛素的代谢模式，因而成 为胰岛素给药方式的研究热点。针对其口服给药所面临的主要问题，如半衰期很短、胃肠道 稳定性差、难以通过胃肠道粘膜等等，不断涌现出脂质体、纳米粒、乳剂、微球等新型药物载 体来实现胰岛素口服递送的目的。
[0003] 近年来高分子材料以及新型药物给药系统的发展迅猛，可生物降解的壳聚糖纳米 粒因其具有无毒、来源广泛、具有良好的生物相容性以及生物降解性而被广泛用作为生物 药品的递送载体。经研究表明，壳聚糖表面荷有大量的正电荷，可以吸附到黏膜表面并迅 速打开上皮细胞之间的紧密连接，以壳聚糖为载体材料包载蛋白多肽类药物制备的纳米 粒，可促进该类药物的跨膜转运以及药物吸收，从而显著提高生物利用率。已有许多研究 表明，胰岛素与壳聚糖形成的纳米粒能够成功地通过细胞旁路途径对胰岛素进行跨膜转运 (K. Sonaje et al. Adv. Funct. Mater. 20 (2010) 3695 - 3700)，提不膜岛素壳聚糖纳米粒作 为口服递送载体，具有良好的发展前景。
[0004] 但受胰岛素理化性质影响，胰岛素壳聚糖纳米粒存在明显缺陷，限制了其进一步 发展。
[0005] 1)在制备过程中蛋白多肽药物易发生变性、突释或泄露
[0006] 胰岛素壳聚糖纳米粒形成机制是基于胰岛素的负电荷与壳聚糖的正电荷相作 用，但由于胰岛素所带负电荷较弱，不能通过电荷引力作用直接与壳聚糖形成稳定的纳 米粒或者其他制剂，已有的制备方法中必须加入交联剂，采用离子交联和化学交联等方 法。其中，离子交联法需要添加三聚磷酸钠或海藻酸钠等作为交联剂，涉及多次洗涤、冻 干等步骤，容易造成药物泄露，交联效率不高，所制得的胰岛素壳聚糖纳米粒于酸性条 件下易解离，突释问题明显且不可预测（Hamman JH.Chitosan based polyelectrolyte complexes as potential carrier materials in drug delivery systems. Mar Drugs. 2010 ;8 (4) : 1305-1322)。而通过化学交联法制备胰岛素-壳聚糖微球，则需要 添加化学交联剂戊二醛等，交联剂毒性大、交联时间较长并且需要机械搅拌等条件，在制 备过程中易导致蛋白质变性失活、微球尺寸不均一，经过复杂的工艺改进之后，药物包封 率依然未會泛高于 65% (Gu Yonghong etal. Preparation of uniform-sized chitosan microspheres and application as carriers for protein drugs. Chinese Journal of Biotechnology, 2006 ;22 (1):150-155.)〇
[0007] 2)增加药物亲脂性会提高载药纳米粒的跨膜转运效率
[0008] 尽管壳聚糖纳米粒可以吸附到黏膜表面并迅速打开上皮细胞之间的紧密连接，但 因胰岛素为大分子的蛋白多肽类物质，亲脂性较差，包载胰岛素的壳聚糖纳米粒的跨膜转 运效果会受到影响。针对以上问题，如果可以在增加胰岛素亲脂性的同时加上壳聚糖纳米 粒的协助入胞作用，会增加载药纳米粒的跨膜转运效率。
[0009] 针对如何提高胰岛素的亲脂性，有大量文献报道，如对胰岛素进行长链脂肪酸 的酯化修饰，能够大大改善其脂溶性（S.R. Myers et al. Acylation of human insulin with palmitic acid extends the time action of human insulin in diabetic acid. Diabetes. 1997, 46:637-642)，然而，通过化学修饰的方法，会对蛋白多肽类药物的高级结 构产生不可逆的影响，并不可避免地对其生物活性产生影响。而已有的研究表明通过制备 胰岛素磷脂复合物，可以在不改变其生物活性的同时，增加胰岛素的脂溶性。
[0010] 磷脂具有较强的荷负电性质，无需外加交联剂即可与壳聚糖通过自组装形成纳 米粒，据此，有文南犬(F. Sonvico etal. Formation of self-organized nanoparticles by lecithin/chitosan interaction, International Journal of Phamacetics 324(2006)67-73)通过溶剂注入法，将脂质材料的甲醇或者乙醇溶液注入至壳聚糖水溶液 中，便得到了由磷脂和壳聚糖层层相互交联的自组装多层囊状结构的纳米粒。由于磷脂的 亲脂性和粘膜渗透性较强，磷脂与壳聚糖形成的纳米粒具有更加出色的跨膜转运能力。同 时，壳聚糖与磷脂相互交联形成的多层囊状结构，最外层为壳聚糖分子层，在一定程度上降 低了磷脂分子层的流动性，使纳米粒的稳定性得到改善。
[0011] 因此，利用磷脂和壳聚糖自组装纳米粒包载药物，受到国内外广泛的关注。但已有 的文献研究同时亦表明，这种纳米粒对于脂溶性药物的包封率较高，对于水溶性药物的包 封率则很低，主要原因是脂溶性药物易于进入多层囊状结构中，而亲水性药物则主要吸附 在外层的壳聚糖分子外围。胰岛素不仅高度亲水，同时还是大分子药物，更是难以被包载进 入磷脂壳聚糖的自组装纳米粒中，而且，胰岛素、磷脂和壳聚糖三者甚至都无法形成澄清透 明的溶液，因此，迄今为止，尚未见胰岛素与磷脂及壳聚糖三者以任何形式组合制备纳米级 或微米级释药载体的研究报道。
【发明内容】
[0012] 本发明的核心内容，是将胰岛素与磷脂先形成药物/磷脂复合物，再将复合物溶 于合适的有机溶剂中形成有机相，注入壳聚糖的水溶液中，通过电荷相互作用，在温和条件 下自组装形成胰岛素一磷脂一壳聚糖微粒载体。当磷脂与壳聚糖相互交联形成多层囊状结 构的过程中，药物会随磷脂一起被包载进入多层囊中间，无需加入交联剂，即可获得包封率 高、稳定性好、突释低的微粒载体，避免因交联反应导致的蛋白变性及药物泄露，有利于改 善跨膜转运和生物吸收。
[0013] 本发明所述的胰岛素一磷脂一壳聚糖自组装微粒载体，主要组成成分为壳聚糖、 磷脂和胰岛素，其中，药物与磷脂的重量比为1:3 - 1:100,优选1:5 - 1:50 ;壳聚糖与磷脂 的重量比为1:5 - 1:50,优选1:10 - 1:40。
[0014] 本发明所述的胰岛素一磷脂一壳聚糖微粒载体，是由胰岛素与全部用量的磷脂先 制成胰岛素磷脂复合物粉末，再将复合物粉末溶于非水溶剂中形成有机相，注入到壳聚糖 的水相溶液中，搅拌条件下，通过电荷作用，自组装形成层层交联的多层囊结构的微粒。调 节制备条件，可获得不同的粒径，范围在50 - 5000nm之间。
[0015] 本发明所述的胰岛素一磷脂一壳聚糖微粒载体，还可是胰岛素与部分磷脂先制成 胰岛素磷脂复合物粉末，再将复合物粉末及剩余量的游离磷脂，一同溶于非水溶剂中形成 有机相，注入到壳聚糖的水相溶液中，搅拌条件下，通过电荷作用，自组装形成层层交联的 多层囊结构的微粒。调节制备条件，可获得不同的粒径，范围在50 - 5000nm之间。
[0016] 胰岛素一磷脂一壳聚糖微粒载体的自组装制备方法中，溶解胰岛素磷脂复合物的 "非水溶剂"，可以是甲醇、乙醇、无水乙醇，还可是乙醚、二氯甲烷，还可是丙酮、乙酸乙酯、 四氢呋喃。相互更换，可得到类似的结果。其中，优选无水乙醇和乙醚。
[0017] 自组装制备方法中，壳聚糖的水相溶液，系用1% (v/v)醋酸或盐酸溶液溶解壳聚 糖，制得含壳聚糖1% (w/V)的母液，再加水稀释至合适的浓度，并调节pH值至5左右，即得 壳聚糖的水相溶液。其中所述的合适浓度，可以是〇.〇5mg/ml，还可以是0. lmg/ml，还可是 0· 2、0· 4、0· 6、0· 8、L Omg/ml，还可是2· 0、3· 0、4· 0、5· Omg/ml。壳聚糖母液及稀释溶液的浓 度及配制方法，可结合壳聚糖理化性质进行调整，并不影响本发明结果。
[0018] 自组装制备方法中，自组装可在磁力搅拌条件下完成，磁力搅拌的转速和保持搅 拌的时间可根据实验结果进行适当调整，并不影响本发明结果。
[0019] 本发明所述的胰岛素磷脂复合物，是药物与磷脂在特定的非质子性溶剂中通过复 合反应而制得。药物与磷脂的重量比为1