分组方法进行药物干预，每组设置6个复孔，3h 后，每孔加入5mg/血的MTT溶液20化继续在CO細胞培养箱中解育4h，然后取出96孔培养板， 弃去上清液，每孔加入15化L的DMS0,放在摇床上振荡lOmin，待紫色结晶完全溶解后用酶标 仪在490nm波长处检测各孔的吸光值。W只加培养液的孔为调零参照(空白对照），细胞活力 用百分比表达，视正常对照组的细胞活性为100%。结果计算：细胞存活率=(实验组OD值-空白对照组OD值)/(正常对照组OD值-空白对照组OD值）X 100 %。
[0034] 4、统计分析
[0035] 采用SPSS17.0分析软件对统计结果进行处理，数据采用单因素方差分析，用均数 ±标准差表示，组间采用单因素方差分析比较，P<〇.05为具有显著性差异，P<0.Ol为极其显 著性差异。
[0036] 5、实验结果
[0037] MTT测试结果显示，与正常对照组细胞比较，模型组细胞活性明显降低(P<0.Ol)， 化合物(式I)干预组细胞活性有所提高，其中低、中、高剂量组细胞活性的升高具有统计学 意义(P<0.0 l)，见表2(与模型组比较*冲<0.0 l)。
[003引表2 .MTT法化合物（I)对出化诱导甜-SY5Y细胞活性的影响
[0040] Ly C i Umam i d e A能抑制此化引起的神经细胞调亡，只能说明其具有神经保护作用， 不能直接说明其可W治疗缺血性脑损伤、脑中风，下面通过动物实验(MACO模型)才证明其 具有治疗缺血性脑损伤、脑中风的作用。
[0041] (四）化合物Lyciumamide A(式I)对大鼠脑缺血再灌注损伤的保护作用
[0042] 实验目的：观察化合物Lyciumamide A对大脑中动脉栓塞(MCAO)大鼠行为学评分 及脑梗死面积的影响，评价Lyciumamide A对脑缺血损伤的保护作用。
[0043] 实验动物：雄性Sprague化Wley(SD)大鼠30只，体重250~280g，由第四军医大学 动物实验中屯、提供。自由进食及饮水，25 ± 2 °C。
[0044] 试剂试药:化合物1^7(3；[111]1日1111(16 4,2,3,5-氯化^苯基四氮挫（1'1'〔，51旨1]1日41化;[证 公司美国），二甲基亚讽(DMS0，SigmaAl化ich公司美国）。
[0045] 动物分组：
[0046] 随机分为6组，每组5只
[0047] (1)假手术组:0.9 %氯化钢注射液
[004引（2 )MCA0模型组:0.9 %氯化钢注射液 [0049] (3)]\^40模型+0150组:20%0150氯化钢溶液
[00加](4)Lyciumamide A低剂量组：10mg/kg [0化1] (S)Lyciumamide A中剂量组：20mg/kg
[0052] (G)Lyciumamide A高剂量组:40mg/kg
[0化3]实验方法：
[0054] 雄性Sprague Dawley(SD)大鼠30只，体重250~280g。随机分为假手术组、MCAO模 型组、MCAO模型+DMSO组，Lyciumamide A高、中、低剂量组，每组5只。假手术组只结扎颈总动 脉、颈内外动脉，不置入线栓;各组均于再灌注即刻腹腔给药。Lyciumamide A低、中、高剂量 组按照10、20、40mg/kg腹膜注射给药化yCiumamide A用20 % DMSO氯化钢溶液溶解）。假手术 组、MCAO模型组及MCAO模型+DMSO组注射等量溶剂。
[0化5] MCAO模型制作参照现有的操作规范(Xonga EZ,Weinstein PR et al.Revers;Lble middle cerebral artery occlusion without craniectomy in rats. Stroke,1989,20 (I)，84-91，1989)，W10 %水合氯醒腹腔注射麻醉，350mg/kg。采用线栓法制备大鼠大脑中 动脉阻闭模型(middle cerebral adery occlusion,MCAO)，取颈正中切口，暴露右侧颈总 动脉、颈外动脉及颈内动脉，结扎颈总动脉、颈外动脉，于颈总动脉分叉下方5mm剪一切口， 置入线栓，深度18mm，并有明显阻力感。大鼠缺血2小时后拔除线栓。采用激光多普勒血流仪 (PefiFlux 5000化rimedAB公司，瑞典）监测脑血流，探头固定于前因后2mm，中线旁开2mm， W大脑中动脉后脑血流量减少超过80%为MCAO模型制备成功的标志。手术过程中监测肛 溫，维持大鼠体溫在37.0 °C~37.5 °C。
[0化6] 神经行为学评分：
[0057]动物清醒后，放回饲养，自由饮食。于再灌注后24小时采用单盲法进行行为学评 分，评分标准为改良Garcia评分标准:包括自主活动、肢体擁痕、攀爬、肢体运动、躯体感觉 及神经反射六项，每项分0，1，2，3分，总分18分，分数越低表明损伤越严重。
[0化引 TTC染色测定梗死面积：
[0059] 评分完成后处死取脑组织，置冰盐水中2分钟后放入脑槽切片，从人字缝分叉处开 始向前每2mm冠状面切一片，共6片。在37°C，2%TTC中染15分钟，4%多聚甲醒固定24小时， 拍照后计算梗死面积，白色为梗死部分，红色为正常组织部分，应用化Otoshop CS6测得像 素值，梗死面积=(左侧正常组织一右侧正常组织)/左侧正常组织。
[0060] 统计学分析：
[0061] 采用SPSS17.0分析软件对统计结果进行处理，数据采用单因素方差分析，用均数 ±标准差表示，组间采用单因素方差分析比较，P<〇.05为具有显著性差异，P<0.Ol为极其显 著性差异。
[0062] 实验结果，参见表3:
[0063] 表3丄yciumamide A对MCAO大鼠神经行为学评分及脑梗塞率的影响
[0065] 与模型组相比，冲<0.05，*冲<0.01 DLyciumamide A低、中、高剂量组行为学评分 及梗死面积明显改善。提示Lyciumamide A对小鼠的脑缺血再灌注损伤有治疗作用，有一定 的剂量依赖性。可见，化合物Lyciumamide A(式I)可用于制备治疗缺血性脑中风药物。
[0066] (五)药物的制备
[0067] 在临床应用时，W常规的制剂工艺，所述的化合物Lyciumamide A(式I)可W单独 使用或与其他药物配合制备成在临床上可W使用的注射剂、散剂、丸剂、胶囊剂、片剂、微囊 剂、软胶囊剂、膜剂、膏剂、町剂、颗粒剂或气雾剂。W下举例说明：
[006引注射剂配方:2mg Lyciumamide A，50mmol/L憐酸缓冲液，总体积ImL。
[0069] 制法:取Lyciumamide A lOmg，加50mmol/L憐酸缓冲液(pH 7.0)5mL，在无菌条件 下完全溶解，分别经过G3和G6玻砂过滤器过滤，灌封于ImL安飯中，100°C灭菌30分钟，得5 支。
[0070] 口服制剂配方:5mg Lyciumamide A，50mg甘露醇，IOOmg可溶性淀粉。
[0071] 制法:取Lyciumamide A 5mg，加50mg甘露醇和100毫克可溶性淀粉，充分混匀后制 粒，所制颗粒包装即得颗粒剂;所制颗粒装于空胶囊壳中，即得胶囊剂;所制颗粒直接压片， 包薄膜衣，即得片剂。
【主权项】
1. 酸酰胺类化合物Lyciumamide A在制备用于防治缺血性脑中风的药物中的应用。2. 酚酰胺类化合物Lyciumamide A在制备用于保护脑缺血损伤的药物中的应用。3. 酸酰胺类化合物Lyciumamide A在制备用于抑制神经细胞死亡的药物中的应用。4. 酚酰胺类化合物Lyciumamide A在制备对脑缺血再灌注损伤具有保护作用的药物中 的应用。5. 如权利要求1、2、3或4所述的应用，其特征在于:所述酸酰胺类化合物Lyciumamide A 的结构如式I所示：6. 如权利要求1、2、3或4所述的应用，其特征在于:所述药物的制剂包括单独使用酚酰 胺类化合物Lyc iumami de A或与其他药物的有效成分配合制备而成的注射剂、散剂、丸剂、 胶囊剂、片剂、微囊剂、软胶囊剂、膜剂、膏剂、酊剂、颗粒剂或气雾剂。
【专利摘要】本发明提供了一种酚酰胺类化合物在防治脑损伤中的应用。该化合物为从枸杞子中提取、分离纯化得到，具有良好的防治缺血性脑损伤效果，而且未见毒副作用，为研制新的保护脑缺血损伤的药物提供先导化合物，可以进一步作为新的治疗脑中风药物进行研究开发，有效解决目前临床上缺乏治疗缺血性脑中风的有效药物的难题。
【IPC分类】A61P25/00, A61K31/165, A61P9/10
【公开号】CN105663102
【申请号】CN201610112169
【发明人】高凯, 汤海峰, 文爱东, 贾艳艳, 刘美佑, 赵瑾怡, 宋颖
【申请人】中国人民解放军第四军医大学
【公开日】2016年6月15日
【申请日】2016年2月29日