蛋白包载方法
【技术领域】
[0001] 本发明设及一种医药技术领域的纳米粒制备方法，具体设及一种蛋白包载方法。
【背景技术】
[0002] 壳聚糖是天然存在的惟一的碱性多糖。它毒性低、可再生，具有优良的生物降解性 和生物亲和性。其分子链上有丰富的径基和氨基，易于进行化学反应。随着高分子材料学和 药剂学的发展，壳聚糖作为一种新型制剂辅料正受到人们的普遍重视。但是壳聚糖不溶于 水和一般的有机溶剂，可溶于稀的无机酸和某些有机酸。壳聚糖只能溶于酸性溶液的缺陷 使其应用受到限制。因为酸性介质易对敏感药物的性能产生干扰，并且容易对生物体产生 毒性。使用壳聚糖季锭化的衍生物不仅保持了分子的阳离子性，还克服了壳聚糖本身溶解 性差的缺点，更加适合作为敏感药物的纳米载体。蛋白类药物药效高，针对性强，副作用低， 但同时由于蛋白类药物在体内外不稳定，十分敏感，若使用乳化聚合法、自动乳化法等包载 蛋白容易使蛋白质变性。因此，使用条件溫和，操作简单的方法制备载蛋白的纳米粒很有意 义。
[0003] 经过对现有技术的文献进行检索发现：中国专利公开号为CN1686560A，公开日为 2005年10月26日，专利名称为壳聚糖季锭盐纳米粒子及其制备方法和用途，该专利是一种 用作药物载体的壳聚糖季锭盐纳米粒子，其不足之处在于药物的释放量较低，造成药物的 浪费。二是未考察壳聚糖季锭盐包载药用蛋白后的粒径、载药量等参数。
【发明内容】
[0004] 针对现有技术中的缺陷，本发明的目的是提供一种蛋白包载方法。本发明的方法 没有使用有机溶剂和有毒的交联剂，操作简单，安全可靠，成本低，制备所得的纳米粒粒径 均一，形态好。适合用于包载蛋白，制备所得的纳米粒载药量高，同时可实现药物的缓慢和 充分释放。
[0005] 本发明的目的是通过W下技术方案实现的：
[0006] 第一方面，本发明设及一种蛋白包载方法，具体为将S聚憐酸钢(TPP)溶液滴加到 含有待包载蛋白的壳聚糖季锭盐溶液中，然后对所得混合溶液离屯、、过滤即可。
[0007] 优选地，所述待包载蛋白包括牛血清白蛋白（BSA)或重组釉原蛋白（rHAm)等。
[000引优选地，所述S聚憐酸钢(TPP)溶液的溶剂为水，溶质S聚憐酸钢在所述溶剂中的 质量浓度为0.35~0.6mg/mL。
[0009] 优选地，所述壳聚糖季锭盐溶液的溶剂为水，溶质壳聚糖季锭盐在所述溶剂中的 质量浓度为1.5~2.3mg/mL所述壳聚糖季锭盐的分子量为SOKDa，取代度为42%。
[0010] 进一步优选地，所述水为超纯水。
[0011] 优选地，所述S聚憐酸钢(TPP)溶液与所述壳聚糖季锭盐溶液的体积比为1:(1~ 2)。
[001 ^ 优选地，所述滴加的速度为0.2~0.8mL/min。
[0013] 优选地，所述滴加采用的设备包括恒流累。
[0014] 优选地，所述滴加完毕后需再揽拌20~40min。
[0015] 优选地，所述离屯、的条件为4500~5000巧111、12~18111111。所述离屯、具体采用高速离 屯、机。
[0016] 优选地，所述过滤具体是：取离屯、所得上清液，通过0.22WI1的滤膜过滤。用滤膜能 过滤除去大分子，实验室常用的滤膜有0.22WI1和0.45WI1两种。使用0.22WI1的滤膜能过滤除 去更多的大分子，使粒径的PDI更小，粒径更均一，从而提高纳米粒的稳定性。
[0017] 第二方面，本发明提供一种通过所述方法获得的蛋白复合体。
[0018] 第=方面，本发明提供一种含有所述蛋白复合体的制品。
[0019] 与现有技术相比，本发明具有如下的有益效果：
[0020] (1)通过使用分子量50KDa，取代度为42%的壳聚糖季锭盐作为载体，使得制备所 得的纳米粒粒径均一，载药量和包封率更高，药物释放量更多；
[0021] (2)通过用高速离屯、机离屯、、0.2化m的滤膜过滤，使得制备所得的纳米粒粒径均 一，PDI在0.16~0.31范围内，纳米粒的稳定性更高；
[0022] (3)通过使用本发明所述的制备方法和浓度比，使得载药纳米粒的药物释放量高， 释放速度快，50小时即可释放药物40~100%。
【附图说明】
[0023] 通过阅读参照W下附图对非限制性实施例所作的详细描述，本发明的其它特征、 目的和优点将会变得更明显：
[0024] 图1为纳米粒的扫描电镜图；
[0025] 其中，(a)是空白纳米粒，(b)为载BSA纳米粒;（C)为载rHAm纳米粒；
[0026] 图2为药物从纳米粒中释放的时间-累积释放度曲线图；
[0027] 其中，（a)是不同HACC浓度条件下制备的载BSA纳米粒，（b)是不同HACC浓度条件下 制备的载rHAm纳米粒。
【具体实施方式】
[0028] 下面结合具体实施例对本发明进行详细说明。W下实施例将有助于本领域的技术 人员进一步理解本发明，但不W任何形式限制本发明。应当指出的是，对本领域的普通技术 人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可W做出若干变形和改进。运些都属于本发明 的保护范围。
[0029] 实施例1
[0030] 本实施例设及空白纳米粒的制备和粒径测定，通过控制反应物的浓度、比例、滴加 速度等，确定形成纳米粒的条件，减少后续制备载药纳米粒的探究步骤。具体操作如下：
[0031] 步骤一，将壳聚糖季锭盐(HACC)溶于超纯水，配制成质量浓度为1.5~2.3mg/血的 壳聚糖季锭盐水溶液。
[0032] 步骤二，将质量浓度为0.35~0.6mg/mL的S聚憐酸钢(TPP)水溶液通过恒流累W 0.2~0.8mL/min的速度滴加到上述溶液中，滴完再揽拌20~AOmiruS聚憐酸钢(TPP)溶液 与壳聚糖季锭盐溶液的体积比控制在1: (1~2)范围内。
[0033] 步骤S，用高速离屯、机W4500~5000巧m、12~18min的条件离屯、。取上清液，用 0.22WI1的滤膜过滤。
[0034] 直接吸取ImL制备完的纳米粒，采用动态光散射仪测定粒径。
[0035] 结果见附表1和表2,由表1和表2可知，TPP浓度的增加会使纳米粒粒径增加，HACC 浓度的增加会使纳米粒粒径减小。同时采用该方法制备所得的纳米粒的粒径比较均一。
[0036] 表1=聚憐酸钢浓度对空白纳米粒粒径的影响
[0039]表2壳聚糖季锭盐浓度对空白纳米粒粒径的影响
[0041 ] 实施例2
[0042] 本实施例设及载BSA纳米粒的制备和粒径测定，具体操作如下：
[0043] 步骤一，将牛血清白蛋白（BSA) W不同的质量浓度0.5、0.9、1.3mg/mL溶于2. Omg/ mL的壳聚糖季锭盐(HACC)水溶液；
[0044] 步骤二，将0.45mg/mL的S聚憐酸钢(TPP)水溶液通过恒流累WO. 2~0.8mL/min的 速度滴加到上述溶液中，滴完再揽拌20~AOmiruS聚憐酸钢(TPP)溶液与壳聚糖季锭盐溶 液的体积比控制在1: (1~2)范围内。
[0045] 步骤S，用高速离屯、机W4500~5000巧m、12~ISmin的条件离屯、。取上清液，用 0.22WI1的滤膜过滤。
[0046] 直接吸取ImL制备完的纳米粒，采用动态光散射仪测定粒径。结果见附表3。由表3 可知，BSA浓度的增加，会使载药纳米粒的粒径增加。
[0047] 表3牛血清白蛋白浓度对载药纳米粒粒径的影响
[0049] 实施例3
[0050] 本实施例设及载rHAm纳米粒的制备，具体操作如下：
[00引]步骤一，将重组釉原蛋白（rHAm似O . 5mg/mL的质量浓度溶于1.5~2.3mg/mL的壳 聚糖季锭盐(HACC)水溶液；
[0化2] 步骤二，将0.35~0.6mg/mL的S聚憐酸钢(TPP)水溶液通过恒流累Wo. 2~O. SmL/ min的速度滴加到上述溶液中，滴完再揽拌20~AOmiruS聚憐酸钢(TPP)溶液与壳聚糖季锭 盐溶液的体积比控制在1: (1~2)范围内。
[0化3] 步骤S，用高速离屯、机W4500~5000巧m、12~ISmin的条件离屯、。取上清液，用 0.22皿的滤膜过滤，即得载rHAm纳米粒。
[0054] 实施例4
[0055] 本实施例设及载药纳米粒载药量和包封率的测定，具体操作如下:
[0056] 将制备所得的纳米粒溶液加入超速离屯、管内，并用超纯水稀释到20mL。在3.0 X 104rpm，4°