一种长双歧杆菌蛋白质用于提升单核增生李斯特菌对抗生素敏感性的应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及微生物技术领域，具体涉及一种长双歧杆菌蛋白质用于提升单核增生 李斯特菌对抗生素敏感性的应用。
【背景技术】
[0002] 双歧杆菌作为肠道益生菌广为人知，近年来针对其肠道益生作用研究发现，双歧 杆菌的某些代谢产物能够抑制其他微生物在肠道内壁的定植，进而降低病原微生物的侵害 风险。该特征目前已经成为筛选双歧杆菌菌种、研发功能性益生菌菌剂的重要依据。
[0003] 现有技术研究发现，双歧杆菌对其他微生物定植于肠道内壁的抑制机制主要是通 过分泌有机酸降低肠道pH值，调节肠道微生态环境，同时分泌胞外酶从而影响致病菌或细 菌毒素的黏附位点及其特异性受体。此外，近年来有学者认为，由双歧杆菌自身黏附于肠道 所引发的占位效应和空间位阻效应可能是阻碍致病菌黏附和入侵的一个重要因素。黏附蛋 白作为双歧杆菌黏附并定植于胃肠道上皮的重要因子，其物质基础、代谢特性在现有技术 中尚无明确结论，
[0004] 尽管现有技术中曾报道部分具有粘附性的双歧杆菌表达蛋白，但其是否就是菌体 定植于肠道内壁的功能性物质尚不明确;此外，在明确获得一种双歧杆菌粘附蛋白的基础 上，为实现进一步的应用，其表达量、纯化效率应当得到优化;再次，针对双歧杆菌粘附蛋 白，应当进一步研究其生物学特性，从而为该粘附蛋白的其他用途奠定基础。
[0005] 长双歧杆菌(Bifidobacterium Iongum)是双歧杆菌属的一种，属革兰氏阳性、无 芽孢、不运动、厌氧性杆菌，广泛存在于人体尤其婴儿的肠道中，属于药品、微生态菌剂制备 领域的常规菌种之一。
【发明内容】
[0006] 本发明旨在针对现有技术的技术缺陷，提供一种长双歧杆菌蛋白质用于提升单核 增生李斯特菌对抗生素敏感性的应用，以解决现有技术中长双歧杆菌蛋白质应用范围存在 局限性的技术问题。
[0007] 本发明要解决的另一技术问题是单核增生李斯特菌对抗生素的敏感性有待提升。
[0008] 为实现以上技术目的，本发明采用以下技术方案：
[0009] 一种长双歧杆菌蛋白质，其氨基酸序列如SEQ ID NO: 1所示。
[0010] -种上述长双歧杆菌蛋白质的制备方法，包括以下步骤：
[0011] 1)制备长双歧杆菌蛋白质的重组大肠杆菌表达菌株；
[0012] 2)取步骤1)所述长双歧杆菌蛋白质的重组大肠杆菌表达菌株进行培养，至培养液 0D600nm为0.6~0.9时加入诱导剂IPTG至终浓度为0.8~1.2mM，而后于35~39°C、震荡条件 下诱导培养4~5h;
[0013] 3)收集菌体、破碎、收集上清；
[0014] 4)取步骤3)上清液，利用GST亲和层析纯化，收集洗脱液后超滤浓缩，脱盐，干燥， 即得到所述长双歧杆菌蛋白质。
[0015] 作为优选，步骤3)所述的破碎是将菌体重悬于PBS缓冲液后，在冰浴条件下超声破 碎20~30次，每次破碎的持续时间为2~4s，每2次破碎之间的时间间隔为4~6s。
[0016] 作为优选，步骤4)具体包括以下操作：
[0017] a)取缓冲液A，以2.5~3.5mL/min的流速平衡谷胱甘肽琼脂糖树脂柱；
[0018] b)取步骤2)上清液，以1~2mL/min的流速上样；
[0019] c)取缓冲液B，以0.8~1.2mL/min的流速洗脱，收集洗脱峰处溶液即为洗脱液；
[0020] d)取洗脱液超滤浓缩，而后过脱盐柱，再利用纯水以2.5~3.5mL/min的流速洗脱， 收集洗脱峰处溶液即为第二洗脱液，而后冷冻干燥，即得到所述长双歧杆菌蛋白质；
[0021] 其中所述缓冲液A是含有1.5~2.5mM EDTA的PBS缓冲液；
[0022] 所述缓冲液B是含有1.5~2.5mM EDTA、15~25mM谷胱甘肽的PBS缓冲液;进一步优 选的，步骤a)中用于平衡谷胱甘肽琼脂糖树脂柱的缓冲液A用量为25~35mL，更优的是 30mL〇
[0023]作为优选，步骤1)中所述的震荡是150~200r/min转速的摇床培养，更优的是 180r/min转速的摇床培养。
[0024]氨基酸序列如SEQ ID N0:1所示的蛋白质用于提升单核增生李斯特菌对抗生素敏 感性的应用;进一步优选的，是上述长双歧杆菌蛋白质作为抗生素抑菌增效剂的应用。
[0025] 作为优选，所述抗生素是β-内酰胺类抗生素;进一步优选的，所述β-内酰胺类抗生 素可以是氨苄青霉素、青霉素 G或头孢霉素。
[0026] 作为优选，所述抗生素是氨基糖苷类抗生素;进一步优选的，所述氨基糖苷类抗生 素是卡那霉素。
[0027] 作为优选，所述抗生素是酰胺醇类抗生素;进一步优选的，所述酰胺醇类抗生素是 氯霉素。
[0028] 作为优选，所述应用是利用含有浓度为45~55yg/mL的、氨基酸序列为SEQ ID NO: 1的蛋白质溶液，以接触方式处理单核增生李斯特菌;进一步优选的，被处理单核增生李斯 特菌在所述蛋白质溶液中的浓度是IO 6CFUAiL;进一步优选的，所述处理时间是1.5~2.5h。
[0029] 在以上技术方案中，所述敏感性是指微生物受抗生素抑制的程度，所述提升微生 物对抗生素敏感性，是指利用含有本发明长双歧杆菌蛋白质的介质孵育微生物后，被处理 微生物在抗生素作用下抑菌效果更为显著。所述长双歧杆菌蛋白质，是说明自然环境下该 蛋白来源于长双歧杆菌，而并不构成对该蛋白质技术特征的限定作用;在本发明中，该蛋白 质的技术特征仅由其序列限定。所述长双歧杆菌蛋白质的重组大肠杆菌表达菌株，是指整 合有本发明长双歧杆菌天然表达基因的重组大肠杆菌;其制备方法通常包括长双歧杆菌总 DNA的提取，目的基因的扩增，扩增产物的纯化，目的基因及载体的酶切、连接，重组载体向 大肠杆菌中的导入，重组子的筛选等步骤;实际制备方法可依据本领域的一般技术常识进 行适应性设计。
[0030] 如前文所述，本发明可用于提升微生物对抗生素的敏感性。但利用本发明长双歧 杆菌蛋白质处理后的物质并不必然予以抗生素处理，当予以抗生素处理时，其处理方法可 采用以下方案:氨苄青霉素作用浓度为1~50yg/mL;青霉素 G作用浓度为1~50yg/mL;头孢 霉素作用浓度为1~50yg/mL;卡那霉素作用浓度为1~25yg/mL;氯霉素作用浓度为1~25μ g/mL〇
[0031] 本发明提供了一种来源于长双歧杆菌的粘附蛋白，并明确了其氨基酸序列；在此 基础上基于遗传工程技术获得了一株该蛋白的表达菌株，并针对菌株及粘附蛋白的特性从 诱导表达、层析纯化、超滤浓缩等方面进行创新性设计，进而获得了上述粘附蛋白的高效制 备方法。进一步的，实验发现该粘附蛋白不仅能够粘附于肠上皮细胞，而且具有提升微生物 抗生素敏感性的作用，基于这种有益的发现，确定了该蛋白作为抗生素抑菌增效剂的用途， 从而扩展了其用途范围，同时提供了一种提升微生物药敏性的新途径。本发明基于严谨的 实验手段获得了突出的技术效果，具有广阔的应用前景。
【附图说明】
[0032] 图1是本发明实施例1中长双歧杆菌特异性蛋白AIP2的表达纯化电泳检测图；图中 泳道M是Protein Marker(12-80kDa);泳道1是E.coli pGEX-4T-l表达产物（对照）；泳道2是 纯化后的AIP2蛋白；泳道3是E.coli pGEX-4T-AIP2融合蛋白表达产物。
[0033] 图2是本发明实施例5中长双歧杆菌特异性蛋白AIP2提升3种常见食源性致病菌对 氨苄青霉素敏感性的实验结果图；图中A部分是长双歧杆菌特异性蛋白AIP2对单核增生李 斯特菌的作用结果;B部分是长双歧杆菌特异性蛋白AIP2对大肠杆菌0157:H7的作用结果;C 部分是长双歧杆菌特异性蛋白AIP2对鼠伤寒沙门氏菌的作用结果。
[0034] 图3是本发明实施例6中长双歧杆菌特异性蛋白AIP2提升3种常见食源性致病菌对 青霉素 G、头孢霉素、卡那霉素、氯霉素敏感性的实验结果图。
【具体实施方式】
[0035] 以下将对本发明的【具体实施方式】进行详细描述。为了避免过多不必要的细节，在 以下实施例中对属于公知的结构或功能将不进行详细描述。
[0036] 以下实施例中所使用的近似性语言可用于定量表述，表明在不改变基本功能的情 况下可允许数量有一定的变动。因此，用"大约"、"左右"等语言所修正的数值不限于该准确 数值本身。在一些实施例中，"大约"表示允许其修正的数值在正负百分之十（10%)的范围 内变化，比如，"大约100"表示的可以是90至IjllO之间的任何数值。此外，在"大约第一数值